עבודה זו נתמכה חלקית על ידי JSPS KAKENHI (מענק מס' 21K08233). אנו מודים לאדנץ (https://jp.edanz.com/ac) על עריכת טיוטות כתב היד.

כל הפרוטוקולים לניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י ובוצעו בהתאם להנחיות השימוש והטיפול בחיות ניסוי של מדריך האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י לחיות מעבדה. כאן, הדגמנו miRNA המחקה העברה לכליה וכתוצאה מכך ביטוי יתר שלה באמצעות עכברי UUO. מחקר זה אושר ?...

<ol>
	<li>Mohr, A. M., Mott, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+microRNA+biology.">Overview of microRNA biology.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).</li><li>Bushati, N., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+functions.">microRNA functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).</li><li>Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+diabetic+nephropathy:+From+biomarkers+to+therapy.">microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy.</a> Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).</li><li>Yheskel, M., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+microRNAs+in+polycystic+kidney+disease.">Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+revolution:+RNA+interference+as+basic+biology,+research+tool,+and+therapeutic.">The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic.</a> Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells.">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li><li>Deng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klotho+gene+delivery+ameliorates+renal+hypertrophy+and+fibrosis+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats+by+suppressing+the+Rho-associated+coiled-coil+kinase+signaling+pathway.">Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressor+of+cytokine+signaling+(SOCS)+2+attenuates+renal+lesions+in+rats+with+diabetic+nephropathy.">Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy.</a> Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).</li><li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors.">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).</li><li>Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+therapy:+Current+state+and+clinical+perspectives.">Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives.</a> Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).</li><li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+microRNA-146a+with+polyethylenimine+nanoparticles+inhibits+renal+fibrosis+in+vivo.">Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).</li><li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease.">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).</li><li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+acute+kidney+injury.">MicroRNA expression profiling in acute kidney injury.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+non-viral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Swami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+and+highly+efficient+nonviral+DNA/siRNA+delivery+system+based+on+PEI-bisepoxide+nanoparticles.">A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+microRNA+expression+in+the+kidneys+of+immunoglobulin+a+nephropathic+mice.">Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).</li><li>Yanai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+evaluation+of+microRNA+expressions+in+mouse+kidney+with+unilateral+ureteral+obstruction.">Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).</li><li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+detection+method+for+microRNAs+in+the+kidney+of+an+ischemic+kidney+injury+mouse+model.">A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).</li><li>Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+anti-fibrotic+activity+of+plasmid+DNA+expressing+small+interference+RNA+for+TGF-beta+type+II+receptor+for+a+mouse+model+of+obstructive+nephropathy+by+cationized+gelatin+prepared+from+different+amine+compounds.">Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).</li><li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+renal+tubulointerstitial+fibrosis+by+small+interfering+RNA+targeting+heat+shock+protein+47.">Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47.</a> American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+of+hepatocyte+growth+factor+to+skeletal+muscle+prevents+changes+in+rat+kidneys+after+5/6+nephrectomy.">In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy.</a> American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).</li><li>Hamar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+targeting+Fas+protects+mice+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenon+preconditioning+protects+against+renal+ischemic-reperfusion+injury+via+HIF-1alpha+activation.">Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNA+knockdown+of+connective+tissue+growth+factor+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction+improves+renal+fibrosis.">Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).</li></ol>

באמצעות הפרוטוקול המוצג בכתב יד זה, PEI-NPs יכולים לספק חיקויי miRNA לכליה כדי לגרום לביטוי יתר של miRNA מטרה, וכתוצאה מכך השפעות טיפול במודלים עכברי in vivo של מספר מחלות כליות, כולל פיברוזיס כליות, מחלת כליות סוכרתית ו- AKI.
השיטה להכנת קומפלקס של PEI-NPs וחיקוי miRNA היא פשוטה מאוד. פני ה...

miRNAs, רנ"א קטן שאינו מקודד (21-25 בסיסים) שאינו מתורגם לחלבונים, מעכב הרבה רנ"א שליח מטרה (mRNAs) על ידי ערעור יציבותם ועיכוב תרגומם במחלות כליות שונות 1,2. לכן, ריפוי גנטי המשתמש בחיקוי או מעכבי miRNA אקסוגניים מסונתזים באופן מלאכותי הוא אפשרות חדשה פוטנציאלית לעיכוב התפתחותן של מחלות כליות רבות 3,4,5.
למרות ההבטחה של miRNA מחקה או מעכבים עבור ריפוי גנטי, משלוח לאיברי המטרה נותר משוכה גדולה עבור ניסויים in vivo לפתח את הפוטנציאל הקליני שלהם. מכיוון שמירנ"א מסונתז באופן מלאכותי מחקה או מעכב נתונים לפירוק מיידי על ידי RNase בסרום, מחצית החיים שלהם מתקצרת עם מתן מערכתי in vivo6. בנוסף, היעילות של miRNA מחקה או מעכב לחצות את קרום הפלזמה ואת הציטופלסמה transfect הוא בדרך כלל הרבה יותר נמוך ללא וקטורים מתאימים 7,8. קווי ראיות אלה מצביעים על כך שנדרש פיתוח מערכת חיקוי או מעכבי miRNA לכלייה, כדי לאפשר את השימוש בהם במסגרות קליניות ולהפוך אותם לאפשרות טיפול חדשה בחולים עם מחלות כליה שונות.
וקטורים נגיפיים שימשו כנשאים להעברת miRNA אקסוגני מחקה או מעכב לכליה 9,10. למרות שהם פותחו עבור בטיחות ביולוגית ויעילות transfection, וקטורים נגיפיים עדיין עלולים לגרום לתגובת אינטרפרון ו / או חוסר יציבות גנטית11,12. כדי להתגבר על חששות אלה, פיתחנו מערכת miRNA המחקה את העברת הכליה באמצעות ננו-חלקיקי פוליאתילנימין (PEI-NPs), וקטור לא ויראלי, במספר מודלים עכבריים של מחלת כליות13,14,15.
PEI-NPs הם NPs ליניאריים מבוססי פולימר שיכולים להעביר ביעילות אוליגונוקלאוטידים, כולל חיקויי miRNA, לכליה, ונחשבים עדיפים להכנת וקטורים לא נגיפיים בגלל בטיחותם לטווח ארוך ותאימות ביולוגית13,16,17.
מחקר זה מדגים את ההשפעות של miRNA אקסוגני שיטתי המחקה העברה עם PEI-NPs באמצעות הזרקת ורידים בזנב בעכברי מודל פיברוזיס כלייתי המיוצרים על ידי חסימת שופכן חד צדדית (UUO). בנוסף, אנו מדגימים את ההשפעות של miRNA אקסוגני שיטתי המחקה העברה עם PEI-NPs באמצעות הזרקת ורידים בזנב בעכברי מודל של מחלת כליות סוכרתית (עכברי db/db: C57BLKS/J Iar -+Lepr db/+Leprdb) ובעכברי מודל של פגיעה חריפה בכליות המיוצרים על ידי פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה כלייתית (IRI).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RPE</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3&#8217; (sense) 
			5&#8217;-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3&#8242; (antisense)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labeled double-strand oligonucleotides</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>MIR7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories Inc</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo-jetPEI</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU 
			UT-3&#8242; (sense) 5&#8217;-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3&#8242; (antisense)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-146a-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Gene design</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG 
			GUU-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-181b-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00006083</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Gene design</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-5100-primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00042952</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)</td>
			<td>Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of exogenous artificially synthesized mirna mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models

מיקרו-רנ"א (miRNAs), רנ"א קטן שאינו מקודד (21-25 בסיסים) שאינו מתורגם לחלבונים, מעכב הרבה רנ"א שליח מטרה (mRNAs) על ידי ערעור ועיכוב תרגומם במחלות כליות שונות. לכן, החלפה של ביטוי miRNA על ידי חיקוי miRNA אקסוגני מסונתז מלאכותית היא אפשרות טיפול שימושית פוטנציאלית לעיכוב התפתחות של מחלות כליות רבות. עם זאת, מכיוון ש-RNAase בסרום מתפרק באופן מיידי בחיקוי miRNA אקסוגני הניתן באופן שיטתי in vivo, אספקת miRNA לכליה נותרה אתגר. לכן, וקטורים שיכולים להגן על miRNA אקסוגני מחקה מפני פירוק על ידי RNAase ולהעביר אותם באופן משמעותי לכליה נחוצים. מחקרים רבים השתמשו בווקטורים נגיפיים כדי להעביר miRNA אקסוגני מחקה או מעכב לכליה. עם זאת, וקטורים נגיפיים עלולים לגרום לתגובת אינטרפרון ו / או חוסר יציבות גנטית. לכן, פיתוח וקטורים נגיפיים הוא גם מכשול לשימוש קליני של miRNA אקסוגני מחקה או מעכבים. כדי להתגבר על חששות אלה בנוגע לווקטורים נגיפיים, פיתחנו שיטה וקטורית לא-ויראלית להעברת חיקויי miRNA לכליה באמצעות הזרקת וריד זנב של ננו-חלקיקי פוליאתילנימין (PEI-NPs), מה שהוביל לביטוי יתר משמעותי של miRNA מטרה במספר מודלים עכבריים של מחלת כליות.

miRNA המטרה עבור פיברוזיס כליות, נפרופתיה סוכרתית, ו AKI המתוארים להלן נבחרו על בסיס מיקרו-מערך, qRT-PCR, ו / או מסד נתונים מחקר עבור יישומי ריפוי גנטי. לפרטים נוספים ראו פרסומים קודמים13,14,15.
העברה והשפעות של miRNA-146a-5p-mimic באמצעות PE...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models at JoVE.c

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

כאן, אנו מספקים חיקויי miRNA אקסוגניים מסונתזים באופן מלאכותי לכליה באמצעות הזרקת וריד זנב של וקטור לא ויראלי וננו-חלקיקי פוליאתילנימין במספר מודלים של עכברים למחלות כליות. זה הוביל לביטוי יתר משמעותי של miRNA המטרה בכליה, וכתוצאה מכך עיכוב התקדמות של מחלת כליות במספר מודלים של עכברים.

העברה של miRNA אקסוגני מסונתז באופן מלאכותי לחקות לכליה באמצעות ננו-חלקיקי פוליאתילנימין במספר מודלים של עכברים למחלות כליות

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בטיפול של microRNA לכליה, אשר נשאר אתגר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת טיפול במיקרו-רנ"א המחקה את הכליה מבלי לגרום לתגובת אינטרפרון או לחוסר יציבות גנטית. התחל על ידי המסת 10 מיקרוליטר של PEI-NPs ב 90 מיקרוליטר של תמיסת גלוקוז 5% בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.לאחר מכן מערבלים את הצינור בעדינות ומסתובבים כלפי מטה. ערבבו 50 מיקרוליטר של miRNA מסונתז באופן מלאכותי המומס ב-100 מיקרומולר של מים נטולי נוקלאז עם 50 מיקרומולר של תמיסת גלוקוז 10% בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מיליליטר. מערבלים את הצינור בעדינות ומסתובבים כלפי מטה.תהליך זה מניב miRNA מומס בתמיסת גלוקוז 5%. לאחר מכן ערבבו 100 מיקרוליטר של PEI-NPs בתמיסת גלוקוז 5% ו-100 מיקרוליטר של miRNA בחיקוי בתמיסת 5% גלוקוז. מערבלים את הצינור בעדינות ומסתובבים כלפי מטה.דוגרים על התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכין קומפלקס יציב של חיקוי miRNA מסוג PEI-NPs. להמיס שני מיקרוליטרים של PEI-NPs ב-98 מיקרוליטר של תמיסת גלוקוז 10% בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. מערבלים את הצינור בעדינות ומסתובבים כלפי מטה.לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של miRNA המסומן Cy3 מחקה ל -100 מיקרוליטר של PEI-NPs בתמיסת גלוקוז 10% ומערבל את הצינור בעדינות. לדגור על התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכין קומפלקס יציב של PEI-NPs-Cy3-labeled-miRNA-mimi. הניחו את עכבר ה-UUO בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר ללא הרדמה ולאחר מכן הניחו את הזנב דרך חור מוכן בפקק.ממלאים מזרק של מיליליטר אחד במחט של 30 מד עם 200 מיקרוליטר של קומפלקס PEI-NPs-Cy3-labeled-miRNA-מחקה והזריקו את הקומפלקס דרך וריד הזנב של העכבר. לאחר מכן, בצע חתך לתוך העור, השרירים והצלעות עם מספריים כירורגיים ומלקחיים כדי לחשוף את הלב. לאחר ביצוע חתך באטריום הימני, יש להזריק PBS לחדר השמאלי עד שצבע הכליה משתנה לצהוב חיוור.זה מצביע על כך שכל גוף העכבר מחורר עם PBS. לאחר איסוף הכליות, להסיר את כמוסות הכליה, ולשטוף אותם פעמיים עם PBS. הטמיעו את דגימות רקמת הכליה בתרכובת OCT והקפיאו אותן בחנקן נוזלי.השתמשו בהקפאה להכנת מקטעים והרכיבו את המקטעים על מגלשות זכוכית מצופות סילאן. תקן אותם עם 4% paraformaldehyde ושטוף בעדינות את המגלשות פעמיים עם PBS. לבסוף, דמיינו את הצביעה הפלואורסצנטית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 100x ו-400x ותוכנת הדמיה מתאימה.התמונה המייצגת מציגה את המבנה של קומפלקס PEI-NPs-miRNA-mimic. ההעברה וההשפעות של miRNA-146a-5p-mimic באמצעות PEI-NPs בפיברוזיס כלייתי מתוארים בתמונות אלה. ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי הראה כי הזרקת PEI-NPs ווריד זנב יכולה לספק את חיקוי miRNA לחלל tubulointerstitial.בעכברי פיברוזיס כליות המיוצרים על ידי UUO, זה כלל תאים צינוריים הכליה שאין להם צורה קבועה בכליה ובגלומרולוס. ניתוח qRT-PCR הראה כי הזרקה של PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic גרמה לביטוי יתר משמעותי של miRNA-146a-5p בכליה. הניתוח ההיסטולוגי עם צביעה אדומה של סיריוס מוצג כאן.ניתוח מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הראה כי הזרקת PEI-NPs מווריד הזנב יכולה לספק חיקוי miRNA לחלל הגלומרולוס והטובולואינטרסטיציאלי בכליות של עכברי מודל כליות סוכרתיים in vivo. בנוסף, ניתוח qRT-PCR הראה כי הזרקת PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic גרמה לביטוי יתר משמעותי של miRNA-181b-5p בכליה. ניתוח היסטולוגי עם צביעת חומצה שיף תקופתית הראה כי הזרקה של PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic פעם בשבוע מגיל 10 עד 20 שבועות עיכבה את התקדמות מחלת כליות סוכרתית בעכברים.העברה והשפעות של PEI-NPs-miRNA-5100-mimic בעכברי מודל של פגיעה חריפה בכליות המיוצרים על ידי פגיעה בזילוח איסכמיה מוצגים כאן. הנתונים של ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי qRT-PCR ניתוח כדי להעריך את השפעות ביטוי היתר של miRNA-5100 לאחר הזרקת PEI-NPs-miRNA-5100-mimic ואת הניתוח ההיסטולוגי של כליה מוכתמת hematoxylin-eosin מתוארים בתמונות אלה. PEI-NPs המוזרקים דרך וריד הזנב יומיים לפני הפגיעה באיסכמיה, או IRI, מונעים התקדמות פגיעה חריפה בכליות הנגרמת על ידי IRI.בעת ביצוע טכניקה זו, להכין חלקים בעובי חמישה מיקרומטר הכוללים רקמת כליה רבה ככל האפשר. אתה יכול גם להכין חלקים בעובי שבעה מיקרומטר.

העברה של miRNA אקסוגני מסונתז באופן מלאכותי לחקות לכליה באמצעות ננו-חלקיקי פוליאתילנימין במספר מודלים של עכברים למחלות כליות

Abstract