Quantificação da Distribuição de Glicogênio Subcelular em Fibras Musculares Esqueléticas usando Microscopia eletrônica de transmissão

Resumo

Um procedimento pós-fixação modificado aumenta o contraste das partículas de glicogênio no tecido. Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo descrevendo como lidar com o tecido, conduzir a imagem e usar métodos esterológicos para obter dados imparciales e quantitativos sobre a distribuição de glicogênio subcelular específico do tipo de fibra no músculo esquelético.

Resumo

Com o uso de microscopia eletrônica de transmissão, podem ser obtidas imagens de alta resolução de amostras fixas contendo fibras musculares individuais. Isso permite quantificações de aspectos ultraestruturais, como frações de volume, proporções de superfície/volume, morfometria e locais de contato físico de diferentes estruturas subcelulares. Na década de 1970, um protocolo para melhor coloração de glicogênio nas células foi desenvolvido e abriu caminho para uma série de estudos sobre a localização subcelular do tamanho de partículas glicogênio e glicogênio usando microscopia eletrônica de transmissão. Enquanto a maioria das análises interpreta o glicogênio como se fosse distribuído homogêneo dentro das fibras musculares, fornecendo apenas um único valor (por exemplo, uma concentração média), a microscopia eletrônica de transmissão revelou que o glicogênio é armazenado como partículas de glicogênio discretas localizadas em compartimentos subcelulares distintos. Aqui, descreve-se o protocolo passo-a-passo da coleta de tecidos para a determinação quantitativa da fração de volume e diâmetro de partículas do glicogênio nos distintos compartimentos subcelulares das fibras musculares esqueléticas individuais. Considerações sobre como 1) coletar e manchar amostras de tecidos, 2) realizar análises de imagem e manuseio de dados, 3) avaliar a precisão das estimativas, 4) discriminar entre tipos de fibras musculares e 5) armadilhas e limitações metodológicas.

Introdução

As partículas glicogênio são compostas de polímeros ramificados de glicose e várias proteínas ^associadas1 e constituem um combustível importante durante altas demandas metabólicas2. Embora não amplamente reconhecidas, as partículas de glicogênio também constituem um combustível local, onde alguns processos subcelulares utilizam preferencialmente o glicogênio, apesar da disponibilidade de outros combustíveis mais duradouros como glicose plasmática e ácidos ^graxos3,4.

A importância de armazenar glicogênio como combustível localizado espe....

Protocolo

O presente protocolo utilizando amostras de músculo esquelético biopsied humano foi aprovado pelos Comitês Regionais de Ética em Pesquisa em Saúde para a Dinamarca do Sul (S-20170198). Biópsias musculares foram obtidas através de uma incisão na pele do músculo vasto lateralis usando uma agulha bergström com sucção após a anestesia local ter sido dada subcutânea (1-3 mL de Lidocaína 2% por incisão). Se utilizados músculos inteiros de ratos isolados, os animais foram sacrificados por luxação cervical antes da obtenção das biópsias musculares, de acordo com as diretrizes do comitê de ética animal do Hospital Universitário Odense, na Dinamarca.

Resultados

Usando este protocolo, as partículas de glicogênio parecem negras e distintas (Figuras 1 e Figura 2). Os valores normais do glicogênio são retratados na Figura 3. Esses dados são baseados em um total de 362 fibras de 41 jovens saudáveis, conforme coletado em diferentes estudos anteriores19,24,29,30,31.

Discussão

A etapa crítica do método é o uso de osmium reduzido por ferrocianídeo de potássio durante a pós-fixação. A seletividade deste fixador modificado para detecção de glicogênio não pode ser totalmente explicada pela química, mas também inclui achados experimentais que demonstram nenhuma detecção de tais partículas em tecidos conhecidos por estarem livres de glicogênio ou no espaço ^{extracelular11}.

Parâmetros críticos são a precisão das estimativas e a.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Propylene oxide	Merck	75-56-9
Embedding 812 resin medium kit	Taab	T031
Glutaraldehyde solution 25%	Merck	1.04239.0250
ITEM	Olympus		Imaging software
Leica EM AC20	Leica		Automatic contrasting system
OSIS Veleta digital camera	Olympus
Osmium tetroxide 4% solution	Polysciences	0972A
Philips CM 100 Transmission EM	Philips
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate	Sigma-Aldrich	455989-245G
Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4	Ampliqon.com	AMPQ40989.0500
Ultra-microtome Leica UC7	Leica
Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution	Leica	16707235
Uranyl acetate dihydrate	Polysciences	6159-44-0