这里,提出了一种分析线虫 秀丽隐杆线虫中蛋白质聚集动力学的方法。来自年龄同步种群的动物在不同的时间点成像,然后在CellProfiler中进行半自动内含物计数,并拟合AmyloFit中的数学模型。
蛋白质聚集成不溶性内含物是多种人类疾病的标志,其中许多疾病与年龄有关。线虫 秀丽隐杆线虫 是一种成熟的模式生物,已在该领域被广泛用于研究蛋白质聚集和毒性。其光学透明度能够通过荧光显微镜直接可视化蛋白质聚集。此外,快速的繁殖周期和较短的寿命使线虫成为筛选调节这一过程的基因和分子的合适模型。
然而,活体动物中聚集负荷的定量标准化较差,通常通过在荧光解剖显微镜下在单个时间点手动计数来进行包涵体计数。这种方法可能导致观察者之间的高度可变性,并限制对聚合过程的理解。相反,淀粉样蛋白样蛋白 在体外 聚集通过硫黄素T荧光以高度定量和时间分辨的方式常规监测。
在这里,提出了一种类似的方法,用于活 秀丽隐杆线虫聚集动力学的无偏分析,使用高通量共聚焦显微镜结合定制的图像分析和数据拟合。该方法的适用性通过监测体壁肌肉细胞中荧光标记的聚谷氨酰胺(polyQ)蛋白的包涵体形成来证明。图像分析工作流程允许确定不同时间点的内含物数量,这些夹杂物拟合到基于单个肌肉细胞中独立成核事件的数学模型中。这里描述的方法可能被证明有助于以稳健和定量的方式评估蛋白质平衡因子和潜在治疗活体动物蛋白质聚集疾病的影响。
错误折叠的蛋白质积累成不溶性沉积物发生在广泛的疾病中。众所周知的例子是阿尔茨海默病中淀粉样蛋白β和tau的聚集,帕金森病中的α突触核蛋白,以及亨廷顿舞蹈症中具有扩增polyQ的亨廷顿蛋白1,2。将这些多肽错误地折叠成淀粉样原纤维与毒性和细胞死亡有关,其机制在很大程度上尚不清楚。阐明淀粉样蛋白形成的机制对于开发目前尚不可用的有效疗法至关重要。
基于硫黄素T荧光测量 ,在体外 进行了淀粉样蛋白形成的详细研究,从而对聚集过程和抑制分子的作用进行了机械理解3,4,5。然而,目前尚不清楚相同的聚集机制是否适用于活细胞和生物体的复杂环境。线虫秀 丽隐杆线虫 是研究体内蛋白质聚集 的合适模式生物。它具有相对简单的解剖结构,但由多个组织组成,包括肌肉,肠道和神经系统。它具有良好的遗传特征,并且很容易获得用于遗传修饰的工具。此外,它的生成时间短至约3天,总寿命为2-3周。因此,可以在实验上方便的时间尺度上检查动物的整个生命周期中的蛋白质聚集。最后,线虫在光学上是透明的,能够追踪活体动物中荧光标记蛋白质的聚集。
秀丽隐杆线虫的这些特征以前已被用于研究polyQ蛋白的聚集,作为亨廷顿舞蹈症和其他polyQ扩增疾病的模型。高于35-40谷氨酰胺残基的致病阈值,可以观察到用黄色荧光蛋白(YFP)标记的polyQ蛋白在肌肉组织6,7,神经元8和肠道9,10中形成不溶性包涵体。这些特征已被广泛用于筛选基因11、12、13和小分子修饰因子14的蛋白质聚集和毒性。
秀丽隐杆线虫 有可能在弥合蛋白质聚集 的体外 研究与更复杂的疾病模型(如小鼠15)之间的差距方面发挥重要作用。 秀丽隐杆线虫 适合于药物筛选16 ,但也可以利用它来获得对蛋白质 在体内聚集的分子机制的基本理解,如最近证明的17所示。然而,对于这两种应用,提取定量和可重复的蛋白质聚集测量值至关重要。在这里,这是通过使用高通量共聚焦显微镜结合专用图像分析管道来实现的(图1)。
1. 秀丽隐杆线虫年龄同步种群的增长
2. 在多孔板中制备 秀丽隐杆线虫 的样品
注意:由于成像程序需要最终会杀死动物的麻醉剂,因此相同的动物不能在随后的时间点重复使用。相反,来自同一年龄同步批次的不同动物在不同的日期进行成像。尽管大多数菌株在第1天几乎没有内含物,但建议将此时间点作为基线。
3. 高通量共聚焦显微镜的图像采集
注意:该实验也可以设置在带有多孔板支架的常规旋转盘共聚焦显微镜上。具有大视场的相机有利于限制需要成像以跨越整个油井的瓷砖数量。有关此方案中使用的显微镜和软件的详细信息,请参阅 材料表 。
4. 在 ImageJ 中拼接平铺图像
注意:仅当使用大于 4x 的物镜时,才需要执行此步骤,其中每个井的图像将作为多个图块进行获取。在此分析工作流程中,使用免费软件FIJI/ImageJ19 执行图块拼接(图2)。根据步骤3中使用的仪器,也可以直接在随附的软件中执行拼接。
5. 使用细胞探查器22 自动计数内含物
6. 使用 AmyloFit5 对内含物计数数据进行全局拟合
注意:仅当多种蛋白质浓度的数据可用时,才能执行此步骤。对于Q40-YFP,先前已经创建了一组四种在体壁肌肉细胞中具有不同水平过表达的菌株17。在其他情况下,应使用质粒显微注射和基因组整合24产生新的菌株。
这里描述的方法(图1)用于分析包含40个与YFP(Q40-YFP)融合的谷氨酰胺的结构的聚集动力学。该蛋白在 unc-54 启动子的控制下表达,驱动体壁肌肉细胞中的表达。由于它们相对较大且易于可视化,因此使用10x物镜足以解析Q40-YFP在该组织中形成的夹杂物。先前开发了四种菌株(系A-D),在不同程度上表达该蛋白以评估 体内17中polyQ聚集的浓度依赖性。
通过2 h产卵产生年龄同步的A-D系种群,然后在后代成年后每日转移。从成年期的第1天到第10天,使用高通量共聚焦显微镜在384孔板中对来自四个菌株中的每一个菌株的20只动物进行成像。井的图像被采集为6个图块,这些图块使用ImageJ21 中的插件拼接在一起(图2)。随后使用定制的CellProfiler22 管道(图3)分析拼接的图像,以量化每个菌株和时间点的每只动物的平均内含物数量。
然后将数据拟合到AmyloFit5中的数学模型(图4)。该模型基于以下假设:95个体壁肌肉细胞中的每一个都通过限速成核事件独立获得一个包涵体,然后快速聚集生长17。拟合得到的成核速率常数为9.9×105个分子M-2.1 d-1 cell-1,反应顺序为2.1,对应于在1 mM的细胞内蛋白浓度下0.38个分子d-1 cell-1的成核速率。两个独立的生物重复导致成核速率和反应顺序的紧密对应值,这与先前使用类似方案17的研究一致(表1)。
(A)年龄同步的秀丽隐杆线虫种群是由定时产卵产生的。(B)在不同时间点的384孔板中对来自同一种群的动物进行成像。(C)将瓷砖缝合在一起以形成整个孔的图像,在CellProfiler中对其进行分析以量化每个动物的内含物数量。(D)使用AmyloFit将数据拟合到数学模型中。请点击此处查看此图的大图。
图 2:使用插件 Grid/Collection 拼接在 ImageJ 中的拼接过程的屏幕截图21。请单击此处查看此图的大图。
图 3:用于量化内含物数量的 CellProfiler 流水线示意图。(A-C) 明场图像 (A) 用于识别蠕虫(B,C 中的特写)。(D-G)荧光图像(D,E中的特写)用于鉴定夹杂物(F)。蠕虫和内含物与提供孔中每个蠕虫的内含物数量相关(G)。显示的图像是成年期第3天的Q40线A动物。请点击此处查看此图的大图。
图 4:将数据拟合到 AmyloFit 中的数学模型。 (A) 数据上传到 AmyloFit。(B)输入自定义方程以模拟包涵体的形成,假设每个细胞中独立的成核事件。(C)表达不同水平Q40-YFP的 秀丽隐杆线 A-D的聚集动力学拟合。这些数据代表了两个独立的生物重复。 请点击此处查看此图的大图。
数据集 1 | 数据集 2 | Sinnige et al.17 | |
n | 2.1 | 1.9 | 1.6 |
K细胞 (分子M-n d-1 细胞-1) | 约9.9 x 105 | 1.4 x 105 | 3.1 x 104 |
1 mM时的成核速率(分子d-1 细胞-1) | 0.38 | 0.21 | 0.35 |
表1:Q40-YFP聚集体的成核速率和反应顺序值。 方案的两个独立生物重复的数据以及与先前发表的数据的比较17.
本文提出的方法有助于对模型生物 秀丽隐杆线虫中的蛋白质聚集动力学进行无偏倚和定量分析。它取决于四个关键要素(图1):1)维持年龄同步的线虫种群;2)多孔板中的荧光显微镜;3)细胞培养器中的自动包涵物计数;4)AmyloFit中的数据拟合。与手动计数自由移动动物或保存图像中的内含物26相比,CellProfiler中的定量更快,更无偏。该协议的另一个关键进步是获取动力学数据,而不是单个时间点,这在将数据拟合到数学模型时为聚合机制提供了定量的见解。
该协议的四个元素可以用作独立的模块,可以根据应用程序进行修改。年龄同步的种群也可以使用5-氟-2′-脱氧尿苷(FUDR)对动物进行绝育。该化合物影响寿命和蛋白质平衡24,25 ,并且对实验者具有高度致癌性;但是,它排除了蠕虫的手动转移,当处理大量蠕虫时,这可能是劳动密集型的。其它替代方法是使用无菌突变体29 或过滤装置来分离后代30。
荧光显微镜步骤也可以调整,例如,使用更高的放大倍率来监测神经元中的蛋白质聚集。当条件之间的相对差异比包涵体的绝对数量更重要时,宽视场显微镜可能足以监测肌肉细胞中的polyQ聚集。在这些情况下,仍然可以使用CellProfiler管道,尽管识别蠕虫和内含物的设置需要由用户进行调整。该技术的通量目前受到需要手动将动物采摘到384孔板中的限制。这可以通过使用微流体装置16来潜在地补救。叠氮化钠是一种相对苛刻的麻醉剂,可以用水凝胶或珠子的物理固定代替28,29。
这里介绍的AmyloFit分析基于由单个细胞中独立成核事件组成的聚集机制。在这种模型不适合的情况下,用户应考虑诸如先前开发的协作聚合模型17的替代方法。这种方法的局限性在于,需要提供以不同浓度表达目标蛋白的菌株,尽管这些菌株可以使用常规 秀丽隐杆线虫 方法24生成。
总而言之,该协议提供了在 体内 模型系统中获取蛋白质聚集动力学的高质量数据的方法,允许对聚集机制17进行详细分析。尽管该方法已被证明可用于 秀丽隐杆线虫 肌肉组织中的polyQ聚集,但该方案的未来应用可能包括其他蛋白质和组织以及蛋白质平衡因子和小分子的作用。
作者没有利益冲突需要披露。
我们感谢森本实验室提供 秀丽隐杆线虫 菌株,并感谢Esmeralda Bosman在高通量共聚焦显微镜方面的帮助。这项工作由乌得勒支大学向T.S.提供的启动补助金资助。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 |
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