Dit werk is ondersteund door NSFC Grant #11775016 en #11635002. JY werd ondersteund door de CMCF van de UCI via NSF DMS 1763272 en de Simons Foundation grant #594598 en start-up fonds van UCI. LTD is ondersteund door Natural Science Foundation van Shanghai #20ZR1425400 en #21JC1403100. We erkennen ook de computationele ondersteuning van het Beijing Computational Science Research Center (CSRC).

1. Constructie van het Markov-toestandsmodel (MSM) op basis van atomaire MD-simulaties
<ol><li>Spontane eiwitstaproute en initiële structurenverzameling<ol>
<li>Gebruik een eerder verkregen MD-traject van 10 μs met alle atomen8 om 10000 frames gelijkmatig te extraheren uit een "voorwaarts" stappenpad van 1 bp (d.w.z. één frame voor elke nanoseconde). Het totale aantal frames moet voldoende groot zijn om alle representatieve conformaties te omvatten.</li>
		<li>Bereid het ove...

Dit werk richt zich op het uitvoeren van op structuur gebaseerde computationele simulatie en bemonsteringen om een transcriptiefactor of TF-eiwit te onthullen dat langs DNA beweegt, niet alleen bij atomaire details van stappen, maar ook in de processieve diffusie, die essentieel is voor de gefaciliteerde diffusie van TF in het DNA-doelonderzoek. Om dat te doen, werd eerst het Markov-toestandsmodel of MSM van een klein TF-domeineiwit WRKY-stepping voor 1-bp langs homogeen poly-A-DNA geconstrueerd, zodat een ensemble van e...

Transcriptiefactoren (TF) zoeken naar het doel-DNA om gentranscriptie en gerelateerde activiteiten te binden en te reguleren1. Afgezien van de driedimensionale (3D) diffusie, is gesuggereerd dat de gefaciliteerde diffusie van TF essentieel is voor doel-DNA-onderzoek, waarbij de eiwitten ook langs eendimensionaal (1D) DNA kunnen glijden of hoppen, of springen met intersegmentale overdracht op het DNA 2,3,4,5,6,7.
In een recente studie hebben we tientallen microseconden (μs) all-atom equilibrium molecular dynamics (MD) simulaties uitgevoerd op een plant TF - het WRKY-domeineiwit op het DNA8. Een volledige 1-bp stap van WRKY op poly-A DNA binnen microseconden is vastgelegd. De bewegingen van het eiwit langs de DNA-groef en waterstofbruggen (HBs) brekende-reformerende dynamiek zijn waargenomen. Hoewel een dergelijk traject één bemonsterd pad vertegenwoordigt, ontbreekt het nog steeds aan een algemeen eiwitstappenlandschap. Hier laten we zien hoe we computationele monsters rond het aanvankelijk gevangen eiwitstappad kunnen uitbreiden met het geconstrueerde Markov-toestandsmodel (MSM), dat op grote schaal is geïmplementeerd voor het simuleren van een verscheidenheid aan biomoleculaire systemen met substantiële conformatieveranderingen en tijdschaalscheiding 9,10,11,12,13,14,15,16, 17,18,19. Het doel is om het conformationele ensemble en de meta-stabiele toestanden van de TF-eiwitdiffusie langs DNA gedurende één cyclische stap te onthullen.
Hoewel de bovenstaande MD-simulatie atomaire resolutie van de eiwitbewegingen gedurende 1 bp op het DNA onthult, is de structurele dynamiek van langdurige processieve diffusie van de TF langs DNA met dezelfde hoge resolutie nauwelijks toegankelijk. Het uitvoeren van grofkorrelige (CG) MD-simulaties op residuniveau is echter technisch benaderbaar. De CG-simulatietijdschaal kan effectief worden uitgebreid tot tientallen of honderden keren langer dan de atoomsimulaties 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29. Hier tonen we de CG-simulaties die zijn uitgevoerd door de Implementatie van de CafeMol-software ontwikkeld door Takada lab30.
In het huidige protocol presenteren we eerst de atoomsimulaties van het WRKY-domeineiwit langs poly-A DNA en de MSM-constructie, die zich richten op het bemonsteren van de eiwitstappende bewegingen voor slechts 1 bp langs DNA. Vervolgens presenteren we de CG-modellering en simulaties van hetzelfde eiwit-DNA-systeem, die de computationele bemonstering uitbreiden naar de eiwitprocesve diffusie over tientallen bps langs DNA.
Hier gebruiken we GROMACS 31,32,33-software om MD-simulaties uit te voeren en MSMbuilder 34 om de MSM te construeren voor bemonsterde conformatiemomentopnamen, evenals om VMD35 te gebruiken om de biomoleculen te visualiseren. Het protocol vereist dat de gebruiker de bovenstaande software kan installeren en implementeren. De installatie en implementatie van de CafeMol30 software is dan noodzakelijk voor het uitvoeren van de CG MD simulaties. Verdere analyses van de trajecten en visualisatie worden ook uitgevoerd in VMD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CafeMol</td>
			<td>Kyoto University</td>
			<td></td>
			<td>coarse-grained (CG) simulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GROMACS</td>
			<td>University of Groningen Royal Institute of Technology Uppsala University</td>
			<td></td>
			<td>molecular dynamics simulations software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Numerical calculation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSMbuilder</td>
			<td>Stanford University</td>
			<td></td>
			<td>build MSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VMD</td>
			<td>UNIVERSITY OF ILLINOIS AT URBANA-CHAMPAIGN</td>
			<td></td>
			<td>molecular visualization program</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structure-based simulation and sampling of transcription factor protein movements along dna from atomic-scale stepping to coarse-grained diffusion

Eendimensionaal (1-D) glijden van transcriptiefactor (TF) eiwit langs DNA is essentieel voor gefaciliteerde diffusie van de TF om de doel-DNA-site voor genetische regulatie te lokaliseren. Het detecteren van basenpaar (bp) resolutie van de TF glijden of stappen op het DNA is nog steeds experimenteel uitdagend. We hebben onlangs all-atom molecular dynamics (MD) simulaties uitgevoerd waarbij spontane 1-bp stappen van een klein WRKY domein TF-eiwit langs DNA worden vastgelegd. Op basis van het 10 μs WRKY-stappad verkregen uit dergelijke simulaties, laat het protocol hier zien hoe uitgebreidere conformatiemonsters van de TF-DNA-systemen kunnen worden uitgevoerd, door het Markov-toestandsmodel (MSM) te construeren voor de 1-bp eiwitstap, met verschillende aantallen micro- en macrotoestanden getest voor de MSM-constructie. Om processieve 1D diffusionele zoektocht van het TF-eiwit samen met structurele basis te onderzoeken, laat het protocol verder zien hoe grofkorrelige (CG) MD-simulaties kunnen worden uitgevoerd om de langetermijnschaaldynamiek van het systeem te bemonsteren. Dergelijke CG-modellering en simulaties zijn bijzonder nuttig om de eiwit-DNA elektrostatische effecten op de processieve diffusieve bewegingen van het TF-eiwit boven tientallen microseconden te onthullen, in vergelijking met sub-microseconden tot microseconden eiwitstapbewegingen onthuld uit de simulaties van alle atomen.

Rotatie-gekoppelde glijding of 1 bp stap van WRKY uit de MSM-constructie Alle eiwitconformaties op het DNA zijn in kaart gebracht aan de longitudinale beweging X en rotatiehoek van het eiwit COM langs DNA (zie figuur 3A). De lineaire koppeling van deze twee graden duidt op rotatie-gekoppelde stappen van het WRKY-domeineiwit op het DNA. De conformaties kunnen verder worden geclusterd in 3 macrotoestanden (S1, S2 en S3) in de MSM. De voorwaartse stap van WRKY volgt dan de m...

Watch this Scientific Journal Video about Structure-Based Simulation and Sampling of Transcription Factor Protein Movements along DNA from Atomic-Scale Stepping to Coarse-Grained Diffusion at JoVE.com

Structure-Based Simulation and Sampling of Transcription Factor Protein Movements along DNA from Atomic-Scale Stepping to Coarse-Grained Diffusion

Het doel van dit protocol is om de structurele dynamiek van eendimensionale diffusie van eiwit langs DNA te onthullen, met behulp van een plantaardig transcriptiefactor WRKY-domeineiwit als een voorbeeldig systeem. Om dit te doen, zijn zowel atomistische als grofkorrelige moleculaire dynamicasimulaties samen met uitgebreide computationele bemonsteringen geïmplementeerd.

Structuurgebaseerde simulatie en bemonstering van transcriptiefactoreiwitbewegingen langs DNA van atomaire schaalstappen naar grofkorrelige diffusie

One-dimensional (1-D) sliding of transcription factor (TF) protein along DNA is essential for facilitated diffusion of the TF to locate target DNA site ...

Het doel van dit protocol is om de structurele dynamiek van eendimensionale diffusie van eiwit langs DNA te onthullen, met behulp van een plantaardig transcriptiefactor WRKY-domeineiwit als een voorbeeldig systeem. De atoomsimulaties onder de Markov-toestandsmodelconstructie onthullen 1-bp stapbewegingen van eiwit langs DNA bij atomaire details. Terwijl de grofkorrelige simulaties zich richten op het bemonsteren van eiwitprocesve diffusies over 10 bps langs DNA.Gebruik om te beginnen een MD-traject van 10 microseconden voor alle atomen om 10.000 frames gelijkmatig naar voren te extraheren, waarbij één basispaar een pad stapt. Bereid het overgangspad voor met 10.000 frames in VMD door op Bestand en Coördinaten opslaan te klikken. Typ vervolgens eiwit of nucleïne in het vak Geselecteerde atomen.Kies Frames in het vak Frames en klik op Opslaan om de benodigde frames op te halen. Lijn de lange as van de referentie van de kristalstructuur van DNA uit op de x-as en stel het initiële massamiddelpunt van de volledige 34 basenparen DNA in aan de oorsprong van de coördinatenruimte door op Extensies te klikken en vervolgens TkConsole in VMD te selecteren. Typ daarna de opdracht in het opdrachtvenster van TkConsole.Bereken vervolgens de vierkantsafstand van de eiwitbackbone door op VMD te klikken, ga vervolgens naar Extensies, klik op Analyse en selecteer het RMSD-trajectgereedschap. Typ in het atoomselectievak nucleïne en residu 14 tot 23 en 46 tot 55. Klik op UITLIJNEN en vervolgens op RMSD vak.Om de rotatiegraad van eiwit rond DNA theta T te berekenen, met de initiële hoekpositie gedefinieerd als theta 0, voert u op het XY-vlak in MATLAB het commando uit. Voer de instructies in MATLAB in om K-means-methoden te gebruiken en classificeer de 10.000 structuren in 25 clusters. Als u klaar bent, verzamelt u de structuren van de 25 clustercentra voor verdere MD-simulatie.Om de eerste ronde MD-simulatie uit te voeren, bouwt u een atomistisch systeem voor de 25 structuren met behulp van GROMACS en het build system sh-bestand. Voer MD-simulaties van 60 nanoseconden uit voor de 25 systemen onder NPT-ensemble met een tijdstap van twee femtoseconden door het commando in de schaal te verwerken. Om de md-trajecten van de eerste ronde te clusteren, verwijdert u de eerste 10 nanoseconden van elk simulatietraject en verzamelt u bevestigingen van de trajecten van 25 keer 50 nanoseconden.Voer voor de tijdonafhankelijke componentanalyse het script in GROMACS in, gevolgd door het kiezen van afstandsparen tussen eiwit en DNA als projectie van invoerparameters. Uit de index. ndx-bestand, naar een nieuwe tekstbestandindex.dat.Als u de paarinformatie tussen deze atomen wilt ophalen, gebruikt u het Python-script. Bereken de 415 afstandsparen van elk traject in het MSMBuilder-opdrachtvenster. Voer vervolgens een tijdonafhankelijke componentanalyse uit om de dimensie van gegevens te verminderen tot de eerste twee keer onafhankelijke componenten of vectoren door de opdracht uit te voeren.Met de verwerking van de instructie in MSMBuilder clustert u de geprojecteerde datasets in 100 clusters met behulp van de case center-methode en selecteert u de centrumstructuur van elk cluster. Om md-simulaties in de tweede ronde uit te voeren, voert u MD-simulaties van 60 nanoseconden uit vanaf de 100 initiële structuren. Nadat u willekeurige beginsnelheden op alle atomen hebt opgelegd, voegt u de willekeurige beginsnelheden toe door de velocity-generatie in het MDP-bestand in te schakelen.Verwijder de eerste 10 nanoseconden van elke simulatie zoals eerder beschreven. En verzamel 2, 500, 000 snapshots van de 100 keer 50 nanoseconde trajecten, gelijkmatig, om de MSM te construeren. Om md-trajecten van de tweede ronde te clusteren, voert u de tijdonafhankelijke componentanalyse uit voor de tweede rondetrajecten in de MSMBuilder zoals weergegeven.En bereken de impliciete tijdschaal om parameters te valideren door het Python-script uit te voeren. Varieer vervolgens de vertragingstijd tau en het aantal microtoestanden door de parameters te wijzigen. Classificeer de bevestigingen in 500 clusters door de opdracht uit te voeren.Voor MSM-constructie, gooi de 500 micro-toestanden in drie tot zes macrotoestanden. Om erachter te komen hoeveel macrotoestanden het beste passen, volgens het PCCAplus-algoritme in MSMBuilder met behulp van het Python-script. Breng de hoogdimensionale bevestigingen aan de X en rotatiehoek van het eiwit langs het DNA voor elke microtoestand in kaart.Om de gemiddelde eerste passagetijden te berekenen, voert u vijf Monte Carlo-trajecten van 10 milliseconden uit, gebaseerd op de overgangskansmatrix van de 500 microtoestand MSM met de vertragingstijd van 10 nanoseconden ingesteld als de tijdstap van Monte Carlo. Bereken de gemiddelde eerste passagetijden tussen elk paar macrotoestanden in het Python-script en het gemiddelde van de standaardfout van de gemiddelde eerste passagetijden met behulp van het Bash-bestand. Voer in de CafeMol 3.0-software de cursussimulatie uit door de opdracht op de terminal uit te voeren.Nadat u de blokken in het invoerbestand hebt opgegeven, stelt u het bestandsnamenblok en het job_cntl blok in met de afzonderlijke opdrachten. Stel vervolgens het unit_and_state blok in, gevolgd door het energy_function blok en het md_information blok. Alle eiwitbevestigingen op het DNA werden toegewezen aan de longitudinale beweging X en rotatiehoek van het eiwit langs DNA, die verder kan worden geclusterd in drie macrotoestanden.De S1-toestand is minder gunstig omdat de waterstofbruggen vergelijkbaar zijn met de gemodelleerde structuur, terwijl S3 verwijst naar een metastabiele toestand waarbij alle waterstofbruggen na één basenpaarstap verschoven en stabiel leken met de hoogste populatie van 63%De tussentoestand S2 verbindt S1 en S3 met een middelhoge populatie van 30% De overgang van S2 naar S3 maakt het collectief breken en hervormen van de waterstofbruggen in ongeveer zeven mogelijk microseconden, terwijl de overgang van S1 naar S2 kan plaatsvinden in ongeveer 0,06 microseconden. De contactnummers tussen eiwit en DNA werden berekend en vier toestanden werden geïdentificeerd. In toestanden 1 en 3 bindt het zinkvingergebied in de richting van de Y.Terwijl in de toestanden 2 en 3 het zinkvingergebied zich bindt in de richting van de Y. De stapgrootte voor elk geconserveerd residu op verschillende DNA-sequenties werd gemeten, waaruit bleek dat de stapgroottes van deze residuen meer gesynchroniseerd zijn op polyA DNA dan op polyAT of willekeurige DNA-sequenties. De belangrijke stappen in de constructie van het Markov-toestandsmodel zijn het kiezen van afstandsparen tussen eiwit- en DNA-gegevensreparaties in de 1-bp stapbewegingen en de selectie van een geschikt aantal microtoestanden en macrotoestanden.

Structuurgebaseerde simulatie en bemonstering van transcriptiefactoreiwitbewegingen langs DNA van atomaire schaalstappen naar grofkorrelige diffusie

Abstract