S.O. er takknemlig til det franske nasjonale forskningsbyrået for å finansiere sin ph.d. (bevilgning ANR-18-CE29-0006).

MERK: En oversikt over protokollen finnes i figur 1. Parametrene som brukes for forsøkene beskrevet i denne protokollen finnes i Supplerende tabell S1 og supplerende tabell S2.
1. Klargjøring av prøveløsningen
MERK: Protokollen er beskrevet ved hjelp av en arabinoxylan pentasaccharide (23-α-L-arabinofuranosyl-xylotetraose eller XA2XX; se materialtabellen) ...

SELECT SERIES Syklisk IMS er et kraftig verktøy som gjør det mulig å velge en definert ionpopulasjon – av en gitt m/z - og ion-mobilitet – uten behov for oppstrøms kromatografisk separasjon. Instrumentet gir mulighet for å generere et bidimensional fragmenteringskart over denne ionpopulasjonen, hvorfra både MS / MS og IMS / IMS-spektra kan trekkes ut. Brukeren må imidlertid merke seg flere kritiske punkter som krever oppmerksomhet under den eksperimentelle prosessen.
Først...

Den komplette kjemiske karakteriseringen av biomolekyler er nøkkelen til å forstå deres underliggende biologiske og funksjonelle egenskaper. For dette formål har "omics" vitenskap utviklet seg de siste årene, med sikte på storskala karakterisering av kjemiske strukturer ved biologiske konsentrasjoner. I proteomikk og metabolomikk har MS blitt et kjerneverktøy for å avdekke den strukturelle heterogeniteten som finnes i biologiske medier , spesielt takket være følsomheten og evnen til å gi strukturell informasjon gjennom tandem MS (MS / MS). I MS / MS-strategier velges en ion i henhold til massen, deretter fragmentert, og til slutt blir massene av fragmentene anskaffet for å etablere et fingeravtrykk av molekylet. Spesielt MS/MS-spektra kan brukes til å samsvare med spektraldatabaser1,2, eller foreløpig rekonstruere de overordnede strukturene3,4. Under forutsetning av at lignende spektra tilhører lignende forbindelser, kan MS/MS-data også brukes til å bygge molekylære nettverk (MNer) som forbinder relaterte arter gjennom en likhetsscore5,6.
Men på grunn av den iboende egenskapen til MS for å oppdage masse-til-lading-forholdet (m / z) av ioner, er teknikken blind for en rekke strukturelle egenskaper som faller innenfor området (stereo)isomerisme. For eksempel er karbohydrater laget av flere monosakkaridunderenheter, hvorav mange er stereoisomerer eller til og med epimers (f.eks. Glc vs. Gal eller Glc vs. Man). Disse underenhetene er forbundet med glykosidiske bindinger, som kan variere ved koblingens posisjon (regioisomerisme) og den steriske konfigurasjonen av det anomeriske karbonet (anomerisme). Disse egenskapene gjør det vanskelig for frittstående MS å skille mellom karbohydrat isomers7, og bare regioisomerisme kan løses ved hjelp av høyenergiaktiveringsmetoder8,9,10. Selv om avledning er et alternativ for å forstyrre ekvivalensen av stereoisomeriske grupper11, krever det omfattende prøvepreparering. Et annet, enklere alternativ er å koble MS med en analytisk dimensjon som er følsom for isomerisme, for eksempel IMS.
Fordi denne protokollen er utformet for brukere som allerede er kjent med de grunnleggende konseptene i IMS, og fordi detaljerte gjennomganger er tilgjengelige andre steder12,13, er bare en kort oversikt over prinsippene for IMS gitt her. IMS er en gassfase separasjonsmetode som er avhengig av samspillet mellom ioner med buffergass og et elektrisk felt, og til slutt skiller ioner i henhold til deres gassfasekonformasjoner. Ulike prinsipper for IMS koblet til MS finnes på kommersielle instrumenter: noen opererer ved vekslende høye og lave elektriske felt (feltasymmetrisk IMS, FAIMS), mens de fleste opererer innenfor grensen for lavt felt – spesielt drivrøret IMS (DTIMS, lineært avtagende elektrisk felt), reisebølge IMS (TWIMS, symmetriske potensielle bølger) og fanget IMS (TIMS, høy strømning av gassfangstioner mot elektriske felt)13 . Lavfeltsmetodene gir tilgang til en såkalt CCS, en egenskap av iongassparet som representerer overflaten (i Å2 eller nm2) av ionen som samhandler med buffergassen under separasjonen. CCS er teoretisk instrumentuavhengig og er derfor nyttig for å generere data som kan reproduseres mellom ulike laboratorier14. Ionmobilitetsseparasjoner kan påvirkes av ulike parametere og spesielt av svingninger i gasstrykket og gasstemperaturen i mobilitetscellen. CCS-kalibreringen er en måte å bøte på dette på, da både kalibrering og art av interesse vil bli påvirket på samme måte13. Det er imidlertid obligatorisk å installere instrumentet i et temperaturkontrollert rom og å ha et pålitelig gasstrykkkontrollsystem.
En interessant utvikling av IMS er IMS/IMS, som først ble introdusert i 2006 av Clemmers gruppe som en analog av MS/MS15,16. I IMS/IMS er en interesseion selektivt isolert basert på ionmobiliteten. Den aktiveres deretter (inntil mulig fragmentering), og en ny IMS-analyse av den aktiverte ionen eller fragmentene utføres. I den første instrumentelle designen ble to IMS-celler satt i serie, skilt av en iontrakt der aktiveringen stod. Siden da, selv om en rekke IMS / IMS-oppsett ble foreslått (for en gjennomgang, se Eldrid og Thalassinos17), ble det første kommersielle massespektrometeret med IMS / IMS-kapasitet bare tilgjengelig i 201918. Dette instrumentet forbedret det opprinnelige konseptet betydelig ved å kombinere det med et annet teknologisk gjennombrudd: en syklisk design av IMS-cellen.
Den sykliske IMS-cellen tillater teoretisk å øke nesten uendelig driftbanelengden og dermed løse kraften til instrumentet19. Dette ble oppnådd ved hjelp av en bestemt instrumentgeometri, hvor den sykliske TWIMS-cellen er plassert ortogonalt til hovedionoptisk akse. Et multifunksjonsmatriseområde ved inngangen til IMS-cellen gjør det mulig å kontrollere retningen på ionbanen: (i) sende ioner sidelengs for IMS-separasjon, (ii) fremover for MS-gjenkjenning, eller (iii) bakover fra IMS-cellen som skal lagres i en prearraycelle. Fra denne prearray butikkcellen kan ionene aktiveres og fragmentene reinjiseres i IMS-cellen for ionmobilitetsmåling, en tilnærming som har blitt brukt til å karakterisere stereoisomerer20. Til syvende og sist inneholder de innsamlede dataene ionmobilitet og m / z-informasjon for forløperen og dens fragmenter.
I en nylig publikasjon som brukte denne sykliske designen for glykananalyser (Ollivier et al.21), viste vi at mobilitetsprofilen til fragmentene i slike IMS/IMS-data fungerer som et fingeravtrykk av en biomolekyl som kan brukes i en molekylær nettverksstrategi. Det resulterende nettverket, kalt IM-MN, førte til organisering av glycomics-datasett på en strukturelt relevant måte, mens nettverket bygget utelukkende fra MS / MS-data (MS-MN) avslørte lite informasjon. For å utfylle denne publikasjonen og hjelpe sykliske IMS-brukere med å implementere denne arbeidsflyten, gir denne protokollen en fullstendig beskrivelse av protokollen som brukes til å samle inn dataene. Denne protokollen fokuserer bare på genereringen av IMS/IMS-dataene som brukere deretter kan bruke til å bygge IM-MN-nettverk (se21) – eller for andre programmer etter eget valg. Bygging av IM-MN vil ikke bli vurdert heri, da protokoller for molekylært nettverk allerede er tilgjengelige22. De avgjørende punktene som må følges for å generere verdifulle og reproduserbare IMS/IMS-oppkjøp, fremheves. Tar eksempelet på en av oligosakkaridene studert av Ollivier et al. 21, er følgende trinn detaljert: (i) prøvepreparering, (ii) justering av det sykliske IMS-instrumentet, (iii) automatisert toppplukking av dataene og (iv) CCS-kalibrering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>33-&#945;-L- plus 23-&#945;-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture</td>
			<td>Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland</td>
			<td>O-XAXXMIX</td>
			<td>XA2XX + XA3XX mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-&#945;-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX)</td>
			<td>Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland</td>
			<td>O-XA3XX</td>
			<td>Pure XA3XX standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm</td>
			<td>Corning Science M&#233;xico S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico</td>
			<td>352070</td>
			<td>Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (ACS reagent, &#8805;99 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France</td>
			<td>310468</td>
			<td>Used to dope the sample with lithium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major Mix IMS/Tof Calibration Kit</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>186008113</td>
			<td>Calibration solution for MS and IMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9)</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>721022377</td>
			<td>Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC PLUS Gradient grade</td>
			<td>Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France</td>
			<td>412383</td>
			<td>High-purity solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Leucine Enkephaline Kit</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>700002456</td>
			<td>Reference compound used for tuning of the mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US</td>
			<td>218012458</td>
			<td>Used to prepare the solution of 500 &#181;M LiCl in 50:50 MeOH/Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SELECT SERIES Cyclic IMS</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>186009432</td>
			<td>Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website: http://mzmine.github.io/</td>
			<td>MZmine Development Team</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the MZmine software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website: https://github.com/siollivier/IM-MN</td>
			<td>INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to an in-house R script containing a CCS calibration function</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a cyclic ion mobility spectrometer for tandem ion mobility experiments

Nøyaktig karakterisering av kjemiske strukturer er viktig for å forstå deres underliggende biologiske mekanismer og funksjonelle egenskaper. Massespektrometri (MS) er et populært verktøy, men er ikke alltid tilstrekkelig til å fullstendig avduke alle strukturelle egenskaper. For eksempel, selv om karbohydrater er biologisk relevante, er karakteriseringen komplisert av mange nivåer av isomerisme. Ion mobility spectrometry (IMS) er et interessant supplement fordi det er følsomt for ionkonformasjoner og dermed til isomerisme. 
Videre har de siste fremskrittene forbedret teknikken betydelig: den siste generasjonen av sykliske IMS-instrumenter tilbyr tilleggsfunksjoner sammenlignet med lineære IMS-instrumenter, for eksempel økt løsningskraft eller muligheten til å utføre tandem ionmobilitetseksperimenter (IMS / IMS). Under IMS/IMS velges en ion basert på ionmobilitet, fragmentert og reanalysert for å få informasjon om iionmobilitet om fragmentene. Nyere arbeid viste at mobilitetsprofilene til fragmentene i slike IMS/ IMS-data kan fungere som et fingeravtrykk av en bestemt glykan og kan brukes i en molekylær nettverksstrategi for å organisere glykomiske datasett på en strukturelt relevant måte. 
Målet med denne protokollen er dermed å beskrive hvordan man genererer IMS/IMS-data, fra prøvepreparering til endelig CCS-kalibrering (Collision Cross Section) av ionmobilitetsdimensjonen som gir reproduserbar spektra. Ved å ta eksempel på en representativ glykan, vil denne protokollen vise hvordan du bygger en IMS/ IMS-kontrollsekvens på et syklisk IMS-instrument, hvordan du tar hensyn til denne kontrollsekvensen for å oversette IMS-ankomsttid til drifttid (dvs. den effektive separasjonstiden som brukes på ionene), og hvordan du trekker ut relevant mobilitetsinformasjon fra rådataene. Denne protokollen er utformet for å tydelig forklare de kritiske punktene i et IMS/IMS-eksperiment og dermed hjelpe nye sykliske IMS-brukere med å utføre enkle og reproduserbare anskaffelser.

En arabinoxylan pentasaccharide, XA2XX, ble valgt som et eksempel for å illustrere denne protokollen. Denne forbindelsen er kommersielt tilgjengelig, men bare som en blanding med en annen arabinoxylan pentasaccharide, XA3XX (ren XA3XX er også kommersielt tilgjengelig). Strukturene i XA2XX og XA3XX er gitt i supplerende figur S1. Siden forholdet mellom XA2XX og XA3XX i den kommersielle blandingen er ~ 50:50, ble en løsning på...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments at JoVE.com

Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments

Ion mobility spectrometry (IMS) er et interessant supplement til massespektrometri for karakterisering av biomolekyler, spesielt fordi det er følsomt for isomerisme. Denne protokollen beskriver et tandem-IMS-eksperiment (IMS/IMS), som tillater isolering av et molekyl og genereringen av mobilitetsprofilene til fragmentene.

Bruke et syklisk ionmobilitetsmåler for tandemionmobilitetseksperimenter

Accurate characterization of chemical structures is important to understand their underlying biological mechanisms and functional properties. Mass ...

Protokollen beskriver hvordan man registrerer en ionmobilitetsprofil for fragmentene som produseres ved aktivering av et molekyl i massespektrometeret, og å diskriminere mellom isomeriske strukturer. Protokollen gjør det mulig å klassifisere glykaner i 11 grupper angående noen av deres viktigste strukturelle egenskaper, og dermed gi en informasjon som ellers er vanskelig å få tak i. Det kan tjene til å bygge molekylære nettverk som er ekstremt generiske og egnet for mange molekylære familier, for eksempel metabolitter eller medikamenter av interesse på mange forskningsområder.Tilnærmingen gjør mest mulig ut av et nytt konsept innen ionmobilitetsspektrometri, og vil være nyttig der massespektrometri alene ikke vil diskriminere mellom to strukturer. Eksperimentet krever en god kommando av massespektrometri og ionmobilitet. Eksperimentet bør imidlertid lykkes med å implementere metoden hvis man følger nøye hvert av trinnene.Å demonstrere prosedyren vil være Simon Ollivier, en stipendiat fra laboratoriet mitt. For å begynne med, sett opp en IMS-sekvens med én omgang fra Tune-siden, sett instrumentet i mobilitetsmodus og åpne vinduet Syklisk sekvenskontroll. Velg Avansert modus på fanen Sykliske funksjoner i dette nye vinduet, velg Legg til bunt, og velg deretter Enkel/multipass.Vent til en sekvens med mobilitetshendelser vises i kategorien Sekvens i samme vindu. Tilpass sekvensen slik at alle kalibrantionene gjør en enkelt pasning rundt den sykliske IMS-racerbanen. Ikke endre innsettingstiden eller utløsings- og anskaffelsestiden, men senk separate klokkeslett til ett millisekund.Hvis noen ioner av kalibreringsblandingen ikke passer inn i det viste ankomsttidsvinduet, endrer du synkroniseringen av IMS med stapperen til den ortogonale akselerasjons-TOF-analysatoren ved å øke antall trykk per skuff i kategorien ADC-innstillinger . Hvis du vil registrere en to-minutters anskaffelse i vinduet Cyclic Sequence Control, klikker du på Hent for å åpne popup-vinduet For anskaffelsesinnstillinger, skriver inn filnavnet, beskrivelsen og lengden på anskaffelsen, minutter og klikker på Lagre. Sett instrumentet i TOF-modus fra MS Tune-siden for å kontrollere stabiliteten til signalet.Registrer et fullstendig MS-oppkjøp av prøven i ett minutt, noe som vil være nyttig for å sjekke det isotopiske mønsteret og tilstedeværelsen av potensielle forurensninger. Plasser instrumentet i MSMS-modus fra kategorien Quad/MS-profil på hovedsiden for melodien. Velg massen av det målrettede jernet i MSMS Mass-feltet for isolasjon i quadrupole.Registrer en ett-minutts anskaffelse for å sjekke forløperisolasjonen når du behandler dataene. Hvis du vil utføre et mobilitetsbasert utvalg av isomeren av interesse, bytter du instrumentet til mobilitetsmodus i vinduet Syklisk sekvenskontroll, velger Legg til pakke i kategorien Sykliske funksjoner og deretter Kutting. Vent til en kompleks sekvens med mobilitetshendelser vises i kategorien Sekvens .Plasser hendelsen Løs ut og Hent rett etter den første Separate-hendelsen, og klikk deretter Kjør. Se etter resultatene av den første separasjonen som skal vises i sanntid. Øk varigheten for den første Separate-hendelsen for en multipass-separasjon ved å endre tidsverdien for denne hendelsen i sekvensen til oppløsningen til IMS-toppene er tilfredsstillende.Registrer en anskaffelse på ett minutt for referanse. Klikk Pause, plasser utløsings- og hent-hendelsen under hendelsene Løs ut, Løs ut til forlager og Hold og løs ut. Juster varigheten til hendelsene slik at den målrettede toppen er i området Løs ut til forhåndslager, og alle andre ioner er enten i området Løs ut eller Hold og løs ut.Plasser utløsings- og anskaffelseshendelsen på slutten av sekvensen under ny prosjekt fra forlageret og de andre separate hendelsene. Klikk Kjør for å vise den valgte populasjonen. Kontroller kvaliteten på isolasjonen.Registrer en anskaffelse på ett minutt for referanse. Se etter de summerte tidspunktene for alle hendelser i kolonnen ved siden av de brukerdefinerte hendelsestidene i kategorien Sekvens . Vær oppmerksom på Time Abs som finnes på linjen til Reinject fra Pre-Store-hendelsen for å utføre CCS-kalibreringen.Angi varigheten for Separate-hendelsen som direkte fortsetter utløsingen og Hent til ett millisekund. Merk av for Aktiver aktivering på linjen Gjenskap fra pre-store, og optimaliser fragmenteringen med den innebygde kontrollen. Hvis fragmenteringen ikke er tilfredsstillende med den innebygde kontrollen, fjerner du merket for Aktiver aktivering og fortsetter å optimalisere reinjeksjonsspenningene manuelt, øker formatrissgraderingen og senker arrayforskyvningsspenningen til resultatene er tilfredsstillende.Hvis du vil registrere et to-minutters oppkjøp i popup-vinduet for anskaffelse, merker du av for Behold drifttid for å generere en fil som bare inneholder ankomsttidene, kontra M over Z merket som _dt.raw. Etter å ha utført MS-analysen av arabinoxylan pentasaccharide-blandingen, viste spekteret et isotopisk mønster med en enkelt topp på M over Z 685,24 som antyder at de to forbindelsene er isomeriske i naturen. Adducts av pentasaccharides ble skilt gjennom den sykliske IMS-cellen, og tre topper ble skilt med forskjellige ankomsttider.Den rene XA3XX viser toppene på 83 og 90 millisekunder, mens XA2XX har en topp på 94 millisekunder. Etter den første fasen av IMS-separasjon ble ioner tilhørende XA3XX kastet ut, og toppen på 94 millisekunder ble valgt for IMS-IMS-analyse. En tre-pass separasjon ble utført etter re-injisering av ion uten aktivering, og en topp for XA2XX ble oppnådd ved 199 millisekunder.De genererte IMS-IMS MS-dataene ble avviklet ved hjelp av ankomsttiden og M over Z-dimensjonene, og genererte IMS-IMS-spektraet. Toppene over 0,2 % relativ intensitet ble eksportert for CCS-kalibrering, noe som resulterte i et sentroidert CCS-kalibrert IMS-IMS-spektrum. Det er alltid viktig å sjekke isolasjonen av forløperionen, ellers kan spekteret komme fra en blanding av forbindelsen av interesse og forurensningene.Vi har tidligere brukt IMS-IMS-spektra til å bygge nettverk og klassifisere forbindelser, men de kan også brukes til å søke mot databaser for sammensatte identifikasjoner. Denne teknikken er veldig nylig, men vi forventer at den vil være ekstremt nyttig i glykomikk så vel som i enhver kontekst der analytikere blir konfrontert med isomeriske molekyler.

Bruke et syklisk ionmobilitetsmåler for tandemionmobilitetseksperimenter

Abstract