Bu çalışma, UIDB/04293/2020 projesi kapsamında FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P. aracılığıyla Ulusal Fonlar tarafından finanse edilmiştir.

C57BL/6 fareler ticari olarak satın alındı ve C57BL/6 arka planındaki hepcidin-null (Hamp1−/-) fareler8 Sophie Vaulont'un (Institut Cochin, Fransa) nazik bir hediyesiydi. Hayvanlar, i3S hayvan tesisinde belirli patojensiz koşullar altında, sıcaklık ve ışık kontrollü bir ortamda, standart kemirgen chow ve suya serbest erişime sahip olarak barındırıldı. Avrupa levreği (Dicentrarchus labrax) ticari bir balık çiftliğinden satın alındı ve ICBAS hay...

<ol>
	<li>Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+carpet+for+iron+metabolism.">A red carpet for iron metabolism.</a> Cell. 168, 344-361 (2017).</li><li>Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepcidin+and+anemia:+A+tight+relationship.">Hepcidin and anemia: A tight relationship.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).</li><li>Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anemia+of+inflammation.">Anemia of inflammation.</a> Blood. 133 (1), 40-50 (2019).</li><li>Altamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+iron+homeostasis:+Lessons+from+mouse+models.">Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models.</a> Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).</li><li>Torrance, J. D., Bothwell, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+measuring+storage+iron+concentrations+in+formalinised+liver+samples.">A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples.</a> South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).</li><li>Torrence, J. D., Bothwell, T. H., Cook, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+iron+stores.">Tissue iron stores.</a> Methods in Haematology. , 104-109 (1980).</li><li>Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanalysis+of+non-heme+iron+in+animal+tissues.">Microanalysis of non-heme iron in animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).</li><li>Lesbordes-Brion, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+hepcidin+1+gene+results+in+severe+hemochromatosis.">Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis.</a> Blood. 108, 1402-1405 (2006).</li><li>Jumbo-Lucioni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+genetics+analysis+of+body+weight+and+energy+metabolism+traits+in+Drosophila+melanogaster.">Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 11, 297 (2010).</li><li>Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+Absorption+in+Drosophila+melanogaster.">Iron Absorption in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).</li><li>Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+non-heme+iron+assay+for+animal+tissues.">High-throughput non-heme iron assay for animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).</li><li>Adrian, W. J., Stevens, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wet+versus+dry+weights+for+heavy+metal+toxicity+determinations+in+duck+liver.">Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver.</a> Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).</li></ol>

Hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, başlangıçta Torrance ve Bothwell tarafından tanımlanan batofenantrolin bazlı kolorimetrik tahlilin adaptasyonu kullanılarak bir protokol sağlanmıştır5,6. Yöntemin kritik adımları doku numunesi kurutma; protein denatürasyonu ve asit hidrolizi ile inorganik demir salınması; indirgeyici ajan tiyoglikolik asit varlığında ferrik (Fe3+) demirin demir durumuna (Fe...

Demir, oksijen taşınması, enerji üretimi veya DNA sentezi gibi önemli biyolojik işlemlerde yer alan proteinlerin işlevi için gerekli olan temel bir mikro besindir. Önemli olarak, hem demir fazlalığı hem de demir eksikliği insan sağlığına oldukça zararlıdır ve doku demir seviyeleri ince bir şekilde düzenlenir. Anormal diyet demir emilimi, demir eksikliği olan diyetler, tekrarlanan kan transfüzyonları ve kronik inflamasyon, dünya çapında milyarlarca insanı etkileyen demir ile ilişkili bozuklukların yaygın nedenleridir1,2,3.
Aşırı demir yükü veya eksikliğinin deneysel hayvan modelleri, demir homeostazının sistemik ve hücresel regülasyonunda yer alan mekanizmalar hakkındaki bilgimizi ilerletmek için etkili olmuştur4. Son yirmi yılda kaydedilen önemli ilerlemelere rağmen, birçok kilit husus belirsizliğini korumaktadır. Önümüzdeki yıllarda, hayvan dokularındaki toplam demir seviyelerinin doğru ölçümü, demir biyolojisi alanındaki araştırmaları ilerletmek için kritik bir adım olmaya devam edecektir.
Çoğu laboratuvar, doku demirini atomik absorpsiyon spektroskopisi (AAS), endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (ICP-MS) veya heme olmayan demirin bir batofenantrolin reaktifi ile reaksiyonuna dayanan kolorimetrik bir tahlil ile ölçer. Sonuncusu, Torrance ve Bothwell tarafından 50 yıl önce tanımlanan orijinal yönteme dayanmaktadır5,6. Bu yöntemin bir varyasyonu daha sonra batofenantropin7'ye alternatif olarak ferrozin kullanılarak geliştirilmiş olsa da, ikincisi literatürde en çok atıfta bulunulan kromojenik reaktif olmaya devam etmektedir.
Tercih edilen yöntem genellikle mevcut uzmanlığa ve altyapıya bağlıdır. AAS ve ICP-MS daha hassas olsa da, kolorimetrik tahlil aşağıdaki önemli avantajları sunduğu için yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir: i) kırmızı kan hücrelerinde bulunan hemoglobinden elde edilen heme demirinin katkısını dışlar; ii) sofistike analitik beceriler veya çok pahalı ekipmanlar gerektirmez; ve iii) orijinal küvet bazlı tahlil, daha yüksek numune verimi sağlayan bir mikroplaka formatına uyarlanabilir. Bu çalışmada sunulan kolorimetrik yaklaşım, kemirgenlerden balıklara ve meyve sineklerine kadar çeşitli deneysel hayvan modellerinde aşırı demir yükü veya demir eksikliği olan doku non-heme demir seviyelerindeki değişiklikleri ölçmek için rutin olarak kullanılmaktadır. Burada, hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, çoğu laboratuvarın uygulamayı kolay bulması gereken basit, iyi kurulmuş, kolorimetrik bir tahlil kullanılarak bir protokol sağlanmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well UV transparent plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Kern</td>
			<td>ABJ 220-4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous sodium acetate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (Mus musculus)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl iron powder, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-0678P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled, sterile water</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microplate reader</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>FLx800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave digestion oven and white teflon cups</td>
			<td>CEM</td>
			<td>MDS-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15687290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>ED115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent chow</td>
			<td>Harlan Laboratories</td>
			<td>2014S</td>
			<td>Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea bass (Dicentrarchus labrax)</td>
			<td>Sonrionansa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea bass feed</td>
			<td>Skretting</td>
			<td>L-2 Alterna 1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single beam UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>UV mini 1240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioglycolic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of tissue non-heme iron content using a bathophenanthroline-based colorimetric assay

Demir önemli bir mikro besindir. Hem aşırı demir yükü hem de eksikliği insanlar için oldukça zararlıdır ve doku demir seviyeleri ince bir şekilde düzenlenir. Demir yükü veya eksikliğinin deneysel hayvan modellerinin kullanılması, demir homeostazının sistemik ve hücresel düzenlenmesinde rol oynayan mekanizmaların bilgisini ilerletmek için etkili olmuştur. Hayvan dokularındaki toplam demir seviyelerinin ölçümü genellikle atomik absorpsiyon spektroskopisi veya heme olmayan demirin bir batofenantrolin reaktifi ile reaksiyonuna dayanan kolorimetrik bir tahlil ile gerçekleştirilir. Uzun yıllar boyunca, kolorimetrik tahlil, çok çeşitli hayvan dokularında heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için kullanılmıştır. Atomik absorpsiyon spektroskopisinden farklı olarak, kırmızı kan hücrelerinde bulunan hemoglobinden türetilen heme demirinin katkısını dışlar. Dahası, sofistike analitik beceriler veya çok pahalı ekipmanlar gerektirmez ve bu nedenle çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilir. Son olarak, kolorimetrik tahlil küvet bazlı olabilir veya daha yüksek numune verimi sağlayan bir mikroplaka formatına uyarlanabilir. Bu çalışma, aşırı demir yükü veya demir eksikliğinin çeşitli deneysel hayvan modellerinde doku demir seviyelerindeki değişikliklerin tespiti için uygun olan iyi kurulmuş bir protokol sunmaktadır.

Cuvette ile 96 kuyucuklu mikro plaka karşılaştırması Doku heme olmayan demirin, orijinal olarak Torrance ve Bothwell tarafından tanımlanan bir batofenantropin reaktifi ile reaksiyona girerek ölçülmesi5,6, absorbans okuması için bir spektrofotometrenin kullanılmasına dayanır. Bu nedenle, kromojen reaksiyonunda kullanılan hacimler, normal bir spektrofotometre küvetinin boyutuyla uyumludur. Bu çalışma, kromojen reaksiyonların...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay at JoVE.com

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Burada, hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilen basit, köklü bir kolorimetrik test kullanılarak bir protokol sağlanmaktadır.

Batofenantropin Bazlı Kolorimetrik Tahlil Kullanılarak Doku Non-Heme Demir İçeriğinin Ölçülmesi

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

Burada hayvan dokularındaki Heme olmayan içerikleri ölçmek için bir protokol sağladık. Çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilen, iyi kurulmuş basit bir kolorimetrik tahlil kullanarak. Batofenantropin Bazlı Kolorimetrik Tahlil, sofistike beceriler veya oldukça pahalı ekipman gerektirmez ve daha yüksek numune verimi ve maliyet etkinliği için mikroplaka formatına uyarlanabilir.Bu protokol, aşırı demir yükü veya demir verimliliği ile ilgili çeşitli deneysel hayvan modellerinde doku demir seviyelerindeki değişiklikleri tespit etmek için uygundur. 10 ila 100 gram ağırlığındaki bir doku örneğini neşter bıçağı ile keserek başlayın. Analitik terazide küçük bir parafilm parçası üzerinde doğru şekilde tartın.Doku parçasını 24 kuyucuklu bir plakaya yerleştirmek için plastik cımbız kullanın. Standart bir inkübatörde 65 santigrat derecede 48 saat kurumaya bırakın. Alternatif olarak, çubuk cımbız kullanarak wade doku parçasını demirsiz bir Teflon bardağa yerleştirin ve laboratuvar mikrodalga sindirim fırınında kurutun.Her kurumuş doku parçasını analitik terazinin içindeki küçük bir paraform parçasının üzerine yerleştirin ve doğru şekilde tartın. Her kurutulmuş doku parçasını 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe asit karışımının bir ışığını ekleyin ve kapatın.Dokunun burada ihmal edilmesi dışında aynı şekilde bir asit boşluğu hazırlayın. Dokuyu sindirmek için tüpleri 20 saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, 500 mikrolitre şeffaf asit ekstraktını yeni bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarmak için plastik uçlarla donatılmış bir mikro pipet kullanın.Kromojen reaksiyonlarını doğrudan düz tabanlı 96 kuyucuklu, berrak işlenmemiş polistiren mikro plakalara hazırlayın. 15 dakika boyunca inkübe edilmiş oda sıcaklığı. Bir plaka okuyucudaki numune emiciliğini, deiyonize su referansına karşı 535 nano metre dalga boyunda ölçün.Küvet ile heme olmayan demirin tayini ve 96 delikli mikroplaka esaslı kolorimetrik tahliller burada gösterilmiştir. Altı aylık erkek siyah, karaciğer, dalak, kalp, akciğer ve kemik iliği dahil olmak üzere altı fareden alınan 55 doku örneğinde küvet bazlı ve mikro plaka bazlı heme olmayan demir seviyeleri arasındaki korelasyon burada gösterilmiştir. İki metodoloji arasındaki yüksek korelasyon, mikro plaka bazlı yöntemin orijinal küvet bazlı yönteme geçerli bir alternatif olduğunu göstermektedir.Son olarak, heme olmayan demir seviyeleri, aynı dokulardan elde edilen numunenin hidroklorik asit ve trikloroasetik asit veya hidroklorik asit karışımı ile asidik sindiriminden sonra mikro plaka bazlı yöntemle ölçülmüştür. Yüksek korelasyon, trikloroasetik asidin asit sindiriminden yayılabileceğini göstermektedir. Temsili görüntü, Bathophenanthroline Based Colorimetric Testi ile ölçülen siyah altı genetik arka plan üzerinde erkek siyah altı vahşi tip farenin ve erkek hepcidin nakavt farelerinin karaciğer, dalak, kalp ve pankreasındaki heme olmayan demir seviyelerini göstermektedir.Hepcidinin bozulması, şiddetli hepatik, pankreas ve kardiyak demir birikimi ve dalak demir tükenmesi ile demir birikimi fenotipi gibi hemokromatoza yol açar. Deneysel demir modülasyonunu takiben genç dişi Avrupa levreklerinde hepatik heme olmayan demir seviyeleri burada gösterilmiştir. Hepatik demir seviyeleri, demir ile muamele edilen hayvanlarda büyük ölçüde artmıştır.Oysa anemi hepatik demir depolarında hafif bir azalmaya neden oldu. Temsili görüntüler, bir aylık Drosophila'da Bathophenanthroline Bazlı Kolorimetrik Tahlil ile ölçülen heme olmayan demir seviyelerini göstermektedir. Sonuçlar, 20 sineğin her havuzundaki heme olmayan demir içeriğini veya her bir sineğin tahmini demir içeriğini göstermektedir.Sinek başına ortalama 0.64 miligram ağırlık göz önüne alındığında. Bu prosedürü denerken tüm cam aşınmasını iyice temizlemeyi unutmayın ve kontaminasyon riski nedeniyle metalik laboratuvar malzemelerinin herhangi bir reaktif veya çözelti ile temas etmesine izin vermeyin.

Batofenantropin Bazlı Kolorimetrik Tahlil Kullanılarak Doku Non-Heme Demir İçeriğinin Ölçülmesi

Abstract