Primaire culturen van rat astrocyten en microglia en hun gebruik in de studie van amyotrofische laterale sclerose

Dit protocol laat zien hoe primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia kunnen worden bereid uit de cortices van Sprague Dawley-ratten en hoe deze cellen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de pathofysiologie van amyotrofische laterale sclerose (ALS) in het rat hSOD1^G93A-model . Ten eerste laat het protocol zien hoe astrocyten en microglia uit postnatale rattencorticosterces kunnen worden geïsoleerd en gekweekt, en vervolgens hoe deze culturen kunnen worden gekarakteriseerd en getest op zuiverheid door immunocytochemie met behulp van de gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP) marker van astrocyten en de geïoniseerde calciumbindende adaptermolecuul 1 (Iba1) microgliale marker. In de volgende fase worden methoden beschreven voor het laden van kleurstoffen (calciumgevoelige Fluo 4-AM) van gekweekte cellen en de opnames van Ca²⁺ veranderingen in videobeeldexperimenten op levende cellen.

De voorbeelden van video-opnames bestaan uit: (1) gevallen van Ca²⁺ beeldvorming van gekweekte astrocyten die acuut zijn blootgesteld aan immunoglobuline G (IgG) geïsoleerd van ALS-patiënten, met een karakteristieke en specifieke respons in vergelijking met de respons op ATP zoals aangetoond in hetzelfde experiment. Voorbeelden tonen ook een meer uitgesproken voorbijgaande stijging van de intracellulaire calciumconcentratie opgewekt door ALS IgG in hSOD1^G93A astrocyten in vergelijking met niet-transgene controles; (2) Ca²⁺ beeldvorming van gekweekte astrocyten tijdens een uitputting van calciumvoorraden door thapsigargin (Thg), een niet-competitieve remmer van het endoplasmatisch reticulum Ca²⁺ ATPase, gevolgd door opgeslagen calciuminvoer opgewekt door de toevoeging van calcium in de opnameoplossing, wat het verschil aantoont tussen Ca²⁺ winkelwerking in hSOD1^G93A en in niet-transgene astrocyten; (3) Ca²⁺ beeldvorming van de gekweekte microglia die voornamelijk een gebrek aan respons op ALS IgG laat zien, terwijl ATP-toepassing een Ca²⁺ verandering veroorzaakte. Dit artikel benadrukt ook mogelijke kanttekeningen en waarschuwingen met betrekking tot kritische celdichtheid en zuiverheid van culturen, waarbij de juiste concentratie van de Ca^{2 +} kleurstof- en kleurstoflaadtechnieken wordt gekozen.