Wij danken Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro en Ania Straatman-Iwanowska voor de deskundige technische bijstand. We bedanken ook Stefan lableden en Ian J. White voor de nuttige discussies. J.J.B. wordt ondersteund door MRC-financiering aan het MRC Laboratory of Molecular Cell Biology aan de UCL, toekenningscode MC_U12266B. C.J.S. wordt ondersteund door MRC-financiering aan het MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit aan de UCL, toekenningscode MC_UU_00012/6. P.G. wordt gefinancierd door de European Research Council, subsidiecode ERC-2013-StG-337057.

Alle dieren werden gehuisvest in overeenstemming met de richtlijnen van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken en het verzamelen van weefsel werd uitgevoerd in overeenstemming met de UK Animal (Scientific Procedures) Act 1986.
1. Fixatie en bereiding van het monster
<ol><li>Ontleed het leverweefsel in stukken van de juiste grootte, ongeveer 8 mm x 8 mm x 3 mm, en plaats de stukken in warme fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS, 37 °C).</li>
	<li>Injecteer kamertemperatuu...

Een toegankelijke vEM-techniek voor het visualiseren van organelstructuur en interacties in 3D wordt in dit protocol beschreven. De morfologie van interorganelle contacten in hepatocyten wordt hier gepresenteerd als een casestudy. Deze aanpak is echter ook toegepast om een verscheidenheid aan andere monsters en onderzoeksgebieden te onderzoeken, waaronder Schwann cel-endotheelinteracties in perifere zenuwen45, Weibel Palade Body biogenese in endotheelcellen46, ladingsecreti...

Sinds hun uitvinding in de jaren 1930 hebben elektronenmicroscopen onderzoekers in staat gesteld om de structurele componenten van cellen en weefsels te visualiseren 1,2. De meeste onderzoeken hebben 2D-informatie opgeleverd, omdat het bouwen van 3D-modellen nauwgezette seriële sectieverzameling, handmatige fotografie, negatieve verwerking, handmatige tracering en het maken en assembleren van 3D-modellen van glasplaten, plastic of piepschuim 3,4 vereist. Bijna 70 jaar later zijn er aanzienlijke vorderingen gemaakt in tal van aspecten van het proces, van microscoopprestaties, seriële sectieverzameling, geautomatiseerde digitale beeldvorming, geavanceerde software en hardware voor 3D-reconstructie, visualisatie en analyse tot alternatieve benaderingen voor wat nu collectief volume EM (vEM) wordt genoemd. Deze vEM-technieken worden over het algemeen beschouwd als het leveren van 3D-ultrastructurele informatie met nanometerresoluties op micronschaal en omvatten transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en nieuwere scanning elektronenmicroscopie (SEM) technieken; zie beoordelingen 5,6,7,8.
Gefocusseerde ionenbundel SEM (FIB-SEM) maakt bijvoorbeeld gebruik van een gerichte ionenbundel in een SEM om het oppervlak van het blok weg te frezen tussen sequentiële SEM-beeldvormingsscans van het oppervlak van het blok, waardoor het herhaalde geautomatiseerd frezen / beeldvormen van een monster mogelijk is en een 3D-dataset kan worden opgebouwd voor reconstructie 9,10. Serial block face SEM (SBF-SEM) daarentegen gebruikt een ultramicrotoom in de SEM om materiaal van het blokvlak te verwijderen voorafgaand aan beeldvorming 11,12, terwijl arraytomografie een niet-destructief proces is dat de verzameling van seriële secties vereist, op coverslips, wafers of tape, voordat een geautomatiseerde workflow wordt opgezet voor het in beeld brengen van het gebied van belang in sequentiële secties in de SEM om de 3D-dataset te genereren13 . Net als bij arraytomografie vereist seriële sectie TEM (ssTEM) dat fysieke secties worden verzameld voorafgaand aan beeldvorming; deze secties worden echter verzameld op TEM-rasters en afgebeeld in een TEM 14,15,16. ssTEM kan worden uitgebreid door tilttomografie 17,18,19 uit te voeren. Seriële tilttomografie biedt de beste resolutie in x, y en z, en hoewel het is gebruikt om hele cellen20 te reconstrueren, is het redelijk uitdagend. Dit protocol richt zich op de praktische aspecten van ssTEM als de meest toegankelijke vEM-techniek die beschikbaar is voor veel EM-laboratoria die momenteel misschien geen toegang hebben tot gespecialiseerde sectioning- of vEM-instrumenten, maar baat zouden hebben bij het genereren van 3D vEM-gegevens.
Seriële ultramicrotomie voor 3D-reconstructie werd eerder als een uitdaging beschouwd. Het was moeilijk om rechte linten van gelijkmatige sectiedikte te knippen, linten van de juiste grootte, in de juiste volgorde, op roosters te plaatsen en op te pakken met voldoende ondersteuning, maar zonder rasterstaven die interessante gebieden verduisteren, en vooral, zonder secties te verliezen, omdat een onvolledige reeks volledige 3D-reconstructie21 kan voorkomen. Verbeteringen aan commerciële ultramicrotomen, diamantslijp- en trimmessen22,23, elektron lucent-ondersteuningsfilms op rasters21,24 en lijmen voor het helpen van sectiehechting en lintconservering13,21 zijn echter slechts enkele van de incrementele vooruitgangen in de loop der jaren die de techniek in veel laboratoria meer routine hebben gemaakt. Zodra seriële secties zijn verzameld, is seriële beeldvorming in TEM eenvoudig en kan EM-afbeeldingen worden geleverd met subnanometer px-formaten in x en y, waardoor hoge resolutie ondervraging van de subcellulaire structuren mogelijk is - een potentiële vereiste voor veel onderzoeksvragen. De hier gepresenteerde casestudy toont het gebruik van ssTEM en 3D-reconstructie in de studie van endoplasmatisch reticulum (ER)-organelcontacten in leverhepatocyten, waar ER-organelcontacten voor het eerst werden waargenomen25,26.
Hoewel het aaneengesloten ligt met de nucleaire envelop, maakt het ER ook nauwe contacten met tal van andere celorganellen, waaronder lysosomen, mitochondriën, lipidedruppels en het plasmamembraan27. ER-organelcontacten zijn betrokken bij lipidemetabolisme28, fosfoinositide en calciumsignalering29, autofagieregulatie en stressrespons30,31. De ER-organelcontacten en andere interorganelle-contacten zijn zeer dynamische structuren die reageren op cellulaire metabole behoeften en extracellulaire signalen. Het is aangetoond dat ze morfologisch variëren in hun grootte en vorm en de afstanden tussen organelmembranen 32,33. Er wordt gedacht dat deze ultrastructurele verschillen waarschijnlijk hun verschillende eiwit / lipidesamenstellingen en functie weerspiegelen34,35. Het is echter nog steeds een uitdagende taak om interorganelle-contacten te definiëren en te analyseren36. Daarom is een betrouwbaar maar eenvoudig protocol voor het onderzoeken en karakteriseren van interorganelle contacten vereist voor verder onderzoek.
Omdat ER-organelcontacten kunnen variëren van 10 tot 30 nm in membraan-tot-membraanscheiding, is de gouden standaard voor identificatie historisch gezien TEM geweest. Thin-section TEM heeft specifieke subdomeinlokalisatie onthuld voor residente ER-eiwitten bij verschillende membraancontacten37. Traditioneel heeft dit ER-organelcontacten met nm-resolutie onthuld, maar vaak alleen een 2D-weergave van deze interacties gepresenteerd. VEM-benaderingen onthullen echter de ultrastructurele presentatie en context van deze contactsites in 3D, waardoor volledige reconstructie van contacten en nauwkeurigere classificatie van contacten (punt versus buisvormig versus cisteraalachtig) en kwantificering38,39 mogelijk is. Naast het feit dat het het eerste celtype is waar ER-organelcontacten25,26 werden waargenomen, hebben hepatocyten een uitgebreid systeem van andere interorganelle contacten die een vitale rol spelen in hun architectuur en fysiologie28,40. Een grondige morfologische karakterisering van ER-organel en andere interorganellecontacten in hepatocyten ontbreekt echter nog steeds. Dienovereenkomstig is de manier waarop interorganelle-contacten zich vormen en hermodelleren tijdens regeneratie en reparatie van bijzonder belang voor de hepatocytenbiologie en de leverfunctie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum trays</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira v6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C/4960/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T027</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>DiaTOME</td>
			<td>ultra 45&#176;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>D032</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers N5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji TrakEM2 plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 36% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>F003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar coated slot grid</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with applicator rod</td>
			<td>Medisca</td>
			<td>6258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15364769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde 25% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>G011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNA/Methyl Nadic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>M011</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 2% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>O005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0050/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reuseable adhesive</td>
			<td>Blue Tack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Lead Citrate</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>L037</td>
			<td>Section stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0250</td>
			<td>to make 0.1 M Caco buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>918-6872</td>
			<td>Cyanoacrylate glue, Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAAB 812 Resin</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T023</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two part Epoxy Resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>132-605</td>
			<td>Alternative: Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>100 &#181;m thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weldwood Original Contact cement</td>
			<td>DAP</td>
			<td>107</td>
			<td>Contact adhesive: Step 3.1.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional characterization of interorganelle contact sites in hepatocytes using serial section electron microscopy

Transmissie-elektronenmicroscopie wordt al lang beschouwd als de gouden standaard voor de visualisatie van cellulaire ultrastructuren. Analyse is echter vaak beperkt tot twee dimensies, wat het vermogen belemmert om de driedimensionale (3D) ultrastructuur en functionele relatie tussen organellen volledig te beschrijven. Volume-elektronenmicroscopie (vEM) beschrijft een verzameling technieken die het mogelijk maken cellulaire ultrastructuur in 3D te ondervragen op mesoschaal, microschaal en nanoschaalresoluties. 
Dit protocol biedt een toegankelijke en robuuste methode om vEM-gegevens te verkrijgen met behulp van SERIAL SECTION TRANSMISSION EM (TEM) en behandelt de technische aspecten van monsterverwerking tot digitale 3D-reconstructie in één eenvoudige workflow. Om het nut van deze techniek aan te tonen, wordt de 3D ultrastructurele relatie tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondriën en hun contactplaatsen in leverhepatocyten gepresenteerd. Interorganelle-contacten spelen een vitale rol bij de overdracht van ionen, lipiden, voedingsstoffen en andere kleine moleculen tussen organellen. Ondanks hun eerste ontdekking in hepatocyten, is er echter nog veel te leren over hun fysieke kenmerken, dynamiek en functies. 
Interorganelle-contacten kunnen een reeks morfologieën weergeven, variërend in de nabijheid van de twee organellen tot elkaar (meestal ~ 10-30 nm) en de omvang van de contactlocatie (van punctate-contacten tot grotere 3D-reservoirachtige contacten). Het onderzoek van nauwe contacten vereist beeldvorming met hoge resolutie en seriële sectie TEM is zeer geschikt om de 3D-ultrastructurele interorganelle contacten tijdens hepatocytendifferentiatie te visualiseren, evenals veranderingen in hepatocytenarchitectuur geassocieerd met metabole ziekten.

Voor deze techniek worden interessante regio's geselecteerd op basis van het biologische onderzoeksdoel en geïdentificeerd voorafgaand aan het trimmen en doorsnijden van ingebed weefsel. Evenzo kan de grootte van het blokvlak worden bepaald door de onderzoeksvraag; in dit geval werd het monster bijgesneden om een blokvlak van ongeveer 0,3 mm x 0,15 mm achter te laten (figuur 4A). Dit maakte twee rasters van 9 seriële secties per raster mogelijk, die 18 seriële secties leverden en een volu...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy at JoVE.com

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Een eenvoudig en uitgebreid protocol om driedimensionale details van membraancontactplaatsen tussen organellen in hepatocyten uit de lever of cellen in andere weefsels te verkrijgen.

Driedimensionale karakterisering van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met behulp van seriële sectie elektronenmicroscopie

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Dit protocol maakt 3D-reconstructie van organellen op een eenvoudige en robuuste manier mogelijk, terwijl het toegankelijk is voor laboratoria die momenteel geen gespecialiseerde volume-elektronenmicroscopen hebben. Deze techniek is uiterst flexibel en biedt een uitstekende X / Y-resolutie, terwijl het indien nodig monsters opnieuw kan afbeelden. Het is ook compatibel met kanteltomografie wanneer een zeer hoge Z-resolutie vereist is.Deze techniek maakt ondervragingen van organelmorfologie in inter-organel context mogelijk. Daarom kan het worden uitgebreid om eventuele pathologische aandoeningen met organeldefecten te onderzoeken. Deze aanpak kan inzicht geven in organelinteracties en cellulaire mensenhandelgebeurtenissen.Deze methode kan ook worden toegepast op andere weefsels, organoïde modellen en celkweeksystemen, naast hepatocyten. Nieuwe gebruikers kunnen seriële secties en oppakken uitdagend vinden zonder verlies. Het wordt aanbevolen om bedreven te zijn in regelmatige ultradunne secties voordat u dit protocol op een kostbaar monster toepast.Begin met het zorgvuldig trimmen van het met hars ingebedde weefsel met behulp van een scheermesje met het monster vergrendeld in de trimadapter. Breng de monster ark samen met de klauwplaat en het monster over naar de monsterarm van de microtome en plaats de specimen ark zo dat het reisbereik van de ark van boven naar beneden loopt. Plaats en vergrendel het diamantmes in de meshouder en zorg ervoor dat de snijhoek van het mes op de juiste manier is ingesteld.Vergrendel de messenhouder stevig in het podium. Schakel de downlighting van het podium uit, zet de uplighting van het podium aan, beweeg het mes voorzichtig naar het monster, pas voortdurend de zijdelingse hoek van het mes, de kanteling van het monster en de rotatie van het monster aan door de relevante knoppen aan te passen totdat het blokvlak is uitgelijnd met de rand van het mes. Plaats de boven- en onderkant van het snijvenster van de monsterarm en laat het monster net onder de mesrand staan.Vul de messenboot met schoon, dubbel gedestilleerd water en zorg ervoor dat het wateroppervlak vlak is met de rand van het mes en licht hol is. Begin vervolgens met het snijden van secties. Stop het snijden net nadat het monster de rand van het mes is gepasseerd.Gebruik een leeg slotraster om het aantal secties te schatten dat op elk raster moet worden verzameld. Gebruik een wimper in elke hand en breek het lint voorzichtig in kleinere linten die in de lengte van het sleufraster passen. Maak een mentale notitie van hun relatieve posities binnen de steekproef.Gebruik een glazen applicatorstaaf en beweeg een druppel chloroform over de secties om ze af te vlakken. Pak het eerste lege slotrooster op met de eerste genummerde tang en dompel het voorzichtig in de Triton X-100 en vervolgens twee keer in het gedestilleerde water. Gebruik een stuk filterpapier om het overtollige water van de rand van de tang te verwijderen.Laat met een tang ongeveer 2/3 van het met formvar gecoate sleufrooster voorzichtig in het water van de messenboot zakken. Zorg ervoor dat de formvarzijde naar beneden is gericht en dat de lange rechterrand van de sleuf zich aan het wateroppervlak bevindt en evenwijdig aan de rand van het water. Waait het rooster voorzichtig in het water naar de linten, zodat bij de terugslag de secties naar het raster afdrijven.Blijf dit doen in steeds kleinere wafts, totdat de rechterrand van het lint uitlijnt met de rechterrand van de sleuf. Breng vervolgens met de laatste waft voorzichtig het raster omhoog om de secties in het sleufraster op te pakken. Plaats verschillende pellets natriumhydroxide onder het deksel van een petrischaal om een kooldioxidevrije omgeving te creëren.Pipetteer vervolgens voorzichtig 40-microliter druppels van Reynold's loodcitraat op de parafilm, één druppel voor elk rooster. Keer elk rooster om op de loodcitraatdruppel en laat het 7 tot 10 minuten beschermd door het deksel van de petrischaal staan. Terwijl de roosters vlekken maken, plaatst u vijf druppels gedestilleerd water van ongeveer 300 microliter voor elk rooster op de parafilm.Breng aan het einde van de loodcitraatincubatie elk rooster over in een druppel gedestilleerd water om gedurende één minuut te wassen zonder direct op de roosters te ademen. Herhaal dit nog vier keer. Gebruik genummerde crossover-tang om het eerste raster op te pakken.Raak de rand van het rooster aan om papier te filteren om het grootste deel van het water af te voeren en laat minstens 20 minuten in de tang drogen. Herhaal dit voor elk raster. Let bij lage vergroting op de volgorde, locatie en positie van de seriële secties.Navigeer naar het middelste gedeelte van de reeks op het raster. Blader door het voorbeeld en identificeer een interessante regio. Observeer vervolgens het monster met de gewenste vergroting.Overweeg de reeks te verzamelen met een iets lagere vergroting, omdat secties vaak niet perfect zijn uitgelijnd en afbeeldingen mogelijk later moeten worden bijgesneden. Maak vervolgens referentieafbeeldingen bij lagere vergrotingen. Dit zal helpen om de context van de interessante regio te waarderen, de ruwe locatie bij verschillende vergrotingen in relatie tot sectiegrenzen en oriëntatiepunten in het voorbeeld.Gebruik deze om de regio-van-belang in andere secties aan te geven. Gebruik voor schermverwijzingen herbruikbare zelfklevende stopverf, stickers of een stuk overheadprojectorpapier dat op het scherm is geplakt om tijdelijke markeringen op het scherm te plaatsen. Dit maakt het mogelijk om routinematig dezelfde kenmerken van het interessegebied in het midden van de afbeelding in de dataset opnieuw voor te stellen.Open de afbeeldingsstapel, geef de voxelmetingen op en selecteer het tabblad Segmentatie om segmentatie te starten. Klik op Nieuw in het deelvenster segmentatie-editor om nieuwe objecten in de materiaallijst te definiëren. Klik met de rechtermuisknop om de kleur van het object te wijzigen en dubbelklik om de naam van het object te wijzigen.Voor handmatige segmentatie kiest u het segmentatiegereedschap onder de materiaallijst en selecteert u het standaardpenseelgereedschap om de pixels te markeren. Het elektronenmicroscopiebeeld van twee tegenover elkaar staande hepatocyten wordt hier getoond. Hogere vergroting beeldvorming maakt de observatie van de morfologische details van de verschillende organellen met nanometer resolutie mogelijk.De representatieve afbeelding toont de gesegmenteerde versie van hetzelfde tomogram, sporen van het endoplasmatisch reticulum, mitochondriën en de intermembrane contacten tussen het ER en de mitochondriën van verschillende ruimtes worden hier getoond. De representatieve afbeelding toont een gekantelde ortho-slice bedekt met segmentatiesporen en zijn relatieve positie binnen het hele mitochondrion. 3D-reconstructie van de gesegmenteerde organellen en de endoplasmatische reticulum-mitochondria-contacten onder verschillende hoeken worden hier getoond.Omdat dit protocol compatibel is met tilttomografie wanneer een zeer hoge Z-resolutie nodig is, helpt het om kleine of ingewikkelde structuren op te lossen. Deze techniek is perfect voor de eerste beoordeling van de ruimtelijke relatie tussen verschillende organellen en daarom bijzonder nuttig in het voortschrijdende veld van membraancontacten bij membraanhomeostase.

three-dimensional-characterization-interorganelle-contact-sites

Driedimensionale karakterisering van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met behulp van seriële sectie elektronenmicroscopie

Abstract