Agradecemos a Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro y Ania Straatman-Iwanowska por su asistencia técnica experta. También agradecemos a los miembros del laboratorio Stefan e Ian J. White por sus útiles discusiones. J.J.B. cuenta con el apoyo de la financiación de MRC para el Laboratorio MRC de Biología Celular Molecular en UCL, el código de premio MC_U12266B. C.J.S. cuenta con el apoyo de la financiación de MRC para la Unidad Universitaria del Laboratorio de Biología Celular Molecular de MRC en UCL, código de premio MC_UU_00012/6. P.G. está financiado por el Consejo Europeo de Investigación, código de subvención ERC-2013-StG-337057.

Todos los animales fueron alojados de acuerdo con las directrices del Ministerio del Interior del Reino Unido, y la recolección de tejidos se llevó a cabo de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986.
1. Fijación y preparación de la muestra
<ol><li>Diseccionar el tejido hepático en trozos de tamaño apropiado, aproximadamente 8 mm x 8 mm x 3 mm, y colocar las piezas en solución salina tamponada con fosfato tibio (PBS, 37 °C)....

En este protocolo se describe una técnica vEM accesible para visualizar la estructura de orgánulos y las interacciones en 3D. La morfología de los contactos interorgánicos en los hepatocitos se presenta como un estudio de caso aquí. Sin embargo, este enfoque también se ha aplicado para investigar una variedad de otras muestras y áreas de investigación, incluidas las interacciones célula-endotelial de Schwann en nervios periféricos45, la biogénesis corporal de Weibel Palade en células e...

Desde su invención en la década de 1930, los microscopios electrónicos han permitido a los investigadores visualizar los componentes estructurales de las células y los tejidos 1,2. La mayoría de las investigaciones han proporcionado información 2D, ya que la construcción de modelos 3D requiere una minuciosa colección de secciones en serie, fotografía manual, procesamiento negativo, rastreo manual y la creación y ensamblaje de modelos 3D a partir de láminas de vidrio, plástico o espuma depoliestireno 3,4. Casi 70 años después, ha habido avances considerables en numerosos aspectos del proceso, desde el rendimiento del microscopio, la recolección de secciones en serie, la imagen digital automatizada, el software y el hardware sofisticados para la reconstrucción, visualización y análisis 3D hasta los enfoques alternativos para lo que ahora se denomina colectivamente EM de volumen (vEM). En general, se considera que estas técnicas de vEM proporcionan información ultraestructural 3D a resoluciones nanométricas a través de escalas de micras y abarcan la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y las nuevas técnicas de microscopía electrónica de barrido (SEM); ver reseñas 5,6,7,8.
Por ejemplo, el haz de iones enfocado SEM (FIB-SEM) utiliza un haz de iones enfocado dentro de un SEM para fresar la superficie del bloque entre escaneos secuenciales de imágenes SEM de la superficie del bloque, lo que permite el fresado / imagen automatizado repetido de una muestra y la construcción de un conjunto de datos 3D para la reconstrucción 9,10. Por el contrario, el SEM de cara de bloque serie (SBF-SEM) utiliza un ultramicrotomo dentro del SEM para eliminar el material de la cara del bloque antes de obtener imágenes11,12, mientras que la tomografía de matriz es un proceso no destructivo que requiere la recopilación de secciones en serie, en hojas de cubierta, obleas o cinta, antes de configurar un flujo de trabajo automatizado de imágenes de la región de interés en secciones secuenciales en el SEM para generar el conjunto de datos 3D13 . Similar a la tomografía de matriz, la sección seriada TEM (ssTEM) requiere que las secciones físicas se recopilen antes de la toma de imágenes; sin embargo, estas secciones se recogen en cuadrículas TEM y se visualizan en un TEM 14,15,16. ssTEM se puede ampliar realizando tomografía de inclinación 17,18,19. La tomografía de inclinación en serie proporciona la mejor resolución en x, y y z, y aunque se ha utilizado para reconstruir células enteras20, es razonablemente desafiante. Este protocolo se centra en los aspectos prácticos de ssTEM como la técnica de vEM más accesible disponible para muchos laboratorios de EM que actualmente no tienen acceso a seccionamiento especializado o instrumentos de vEM, pero se beneficiarían de la generación de datos de vEM 3D.
La ultramicrotomía en serie para la reconstrucción 3D se ha considerado previamente un desafío. Era difícil cortar cintas rectas de espesor de sección uniforme, poder organizar y recoger cintas del tamaño correcto, en el orden correcto, en rejillas con suficiente soporte, pero sin barras de rejilla que oscurecieran las regiones de interés, y lo más importante, sin perder secciones, ya que una serie incompleta puede evitar la reconstrucción 3D completa21. Sin embargo, las mejoras en los ultramicrotomías comerciales, los cuchillos de corte y recorte de diamantes22,23, las películas de soporte de electrones en rejillas21,24 y los adhesivos para ayudar a la adhesión de la sección y la preservación de la cinta13,21 son solo algunos de los avances incrementales a lo largo de los años que han hecho que la técnica sea más rutinaria en muchos laboratorios. Una vez que se han recopilado las secciones en serie, las imágenes en serie en TEM son sencillas y pueden proporcionar imágenes EM con tamaños de px del subnanómetro en x e y, lo que permite el interrogatorio de alta resolución de las estructuras subcelulares, un requisito potencial para muchas preguntas de investigación. El estudio de caso aquí presentado demuestra el uso de ssTEM y reconstrucción 3D en el estudio de los contactos endoplásmicos retículo (RE)-orgánulo en hepatocitos hepáticos, donde se observaron por primera vez contactos ER-orgánulos25,26.
Si bien es contiguo con la envoltura nuclear, el RE también hace contactos cercanos con muchos otros orgánulos celulares, incluidos los lisosomas, las mitocondrias, las gotas de lípidos y la membrana plasmática27. Los contactos ER-orgánulos se han implicado en el metabolismo lipídico28, la señalización de fosfoinositida y calcio29, la regulación de la autofagia y la respuesta al estrés30,31. Los contactos ER-orgánulos y otros contactos interorgánicos son estructuras altamente dinámicas que responden a las necesidades metabólicas celulares y las señales extracelulares. Se ha demostrado que varían morfológicamente en su tamaño y forma y las distancias entre las membranas de orgánulos32,33. Se cree que es probable que estas diferencias ultraestructurales reflejen sus diferentes composiciones de proteínas/lípidos y su función34,35. Sin embargo, sigue siendo una tarea difícil definir los contactos interorgánicos y analizarlos36. Por lo tanto, se requiere un protocolo confiable pero simple para examinar y caracterizar los contactos interorgánicos para futuras investigaciones.
Como los contactos ER-orgánulo pueden variar de 10 a 30 nm en la separación de membrana a membrana, el estándar de oro para la identificación ha sido históricamente TEM. Tem de sección delgada ha revelado localización específica de subdominios para proteínas ER residentes en distintos contactos de membrana37. Tradicionalmente, esto ha revelado contactos de orgánulos ER con resolución nm, pero a menudo solo presentaba una vista 2D de estas interacciones. Sin embargo, los enfoques vEM revelan la presentación ultraestructural y el contexto de estos sitios de contacto en 3D, lo que permite la reconstrucción completa de los contactos y una clasificación más precisa de los contactos (punto vs. tubular vs. cisternal-tipo) y cuantificación38,39. Además de ser el primer tipo celular donde se observaron contactos ER-orgánulo25,26, los hepatocitos tienen un extenso sistema de otros contactos interorgánicos que cumplen funciones vitales en su arquitectura y fisiología28,40. Sin embargo, todavía falta una caracterización morfológica completa del orgánulo ER y otros contactos interorgánicos en los hepatocitos. En consecuencia, la forma en que los contactos interorgánicos se forman y remodelan durante la regeneración y la reparación es de particular relevancia para la biología de los hepatocitos y la función hepática.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum trays</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira v6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C/4960/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T027</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>DiaTOME</td>
			<td>ultra 45&#176;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>D032</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers N5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT5293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji TrakEM2 plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 36% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>F003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar coated slot grid</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with applicator rod</td>
			<td>Medisca</td>
			<td>6258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15364769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde 25% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>G011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNA/Methyl Nadic Anhydride</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>M011</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 2% solution</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>O005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0050/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reuseable adhesive</td>
			<td>Blue Tack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Lead Citrate</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>L037</td>
			<td>Section stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0250</td>
			<td>to make 0.1 M Caco buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>918-6872</td>
			<td>Cyanoacrylate glue, Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAAB 812 Resin</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T023</td>
			<td>Epon ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>T046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two part Epoxy Resin</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>132-605</td>
			<td>Alternative: Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>100 &#181;m thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weldwood Original Contact cement</td>
			<td>DAP</td>
			<td>107</td>
			<td>Contact adhesive: Step 3.1.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional characterization of interorganelle contact sites in hepatocytes using serial section electron microscopy

La microscopía electrónica de transmisión se ha considerado durante mucho tiempo como el estándar de oro para la visualización de la ultraestructura celular. Sin embargo, el análisis a menudo se limita a dos dimensiones, lo que dificulta la capacidad de describir completamente la ultraestructura tridimensional (3D) y la relación funcional entre los orgánulos. La microscopía electrónica de volumen (vEM) describe una colección de técnicas que permiten el interrogatorio de la ultraestructura celular en 3D a resoluciones de mesoescala, microescala y nanoescala. 
Este protocolo proporciona un método accesible y robusto para adquirir datos vEM utilizando la transmisión de sección serie EM (TEM) y cubre los aspectos técnicos del procesamiento de muestras hasta la reconstrucción digital en 3D en un flujo de trabajo único y sencillo. Para demostrar la utilidad de esta técnica, se presenta la relación ultraestructural 3D entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias y sus sitios de contacto en los hepatocitos hepáticos. Los contactos interorgánicos desempeñan funciones vitales en la transferencia de iones, lípidos, nutrientes y otras moléculas pequeñas entre orgánulos. Sin embargo, a pesar de su descubrimiento inicial en los hepatocitos, todavía hay mucho que aprender sobre sus características físicas, dinámicas y funciones. 
Los contactos interorgánicos pueden mostrar una variedad de morfologías, que varían en la proximidad de los dos orgánulos entre sí (típicamente ~ 10-30 nm) y la extensión del sitio de contacto (desde contactos punteados hasta contactos cisternales 3D más grandes). El examen de contactos cercanos requiere imágenes de alta resolución, y la TEM de sección seriada es muy adecuada para visualizar la ultraestructural 3D de los contactos interorgánicos durante la diferenciación de hepatocitos, así como las alteraciones en la arquitectura de los hepatocitos asociadas con enfermedades metabólicas.

Para esta técnica, las regiones de interés se seleccionan en función del objetivo de la investigación biológica y se identifican antes del recorte y seccionamiento del tejido incrustado. Del mismo modo, el tamaño de la cara del bloque puede ser dictado por la pregunta de investigación; en este caso, la muestra se recortó para dejar una cara de bloque de aproximadamente 0,3 mm x 0,15 mm (Figura 4A). Esto permitió dos rejillas de 9 secciones en serie por rejilla, proporcionando 18 sec...

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Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Un protocolo simple y completo para adquirir detalles tridimensionales de los sitios de contacto de membrana entre orgánulos en hepatocitos del hígado o células en otros tejidos.

Caracterización tridimensional de sitios de contacto interorgánicos en hepatocitos mediante microscopía electrónica de sección serie

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Este protocolo permite la reconstrucción 3D de orgánulos de forma sencilla y robusta, a la vez que es accesible a laboratorios que actualmente no cuentan con microscopios electrónicos de volumen especializados. Esta técnica es extremadamente flexible, proporcionando una excelente resolución X / Y, al tiempo que puede volver a obtener muestras si es necesario. También es compatible con la tomografía basculante cuando se requiere una resolución Z muy alta.Esta técnica permite interrogar la morfología de los orgánulos en contextos interorgánulos. Por lo tanto, se puede extender para examinar cualquier condición patológica con defectos de orgánulos. Este enfoque puede proporcionar información sobre las interacciones de orgánulos y los eventos de tráfico celular.Este método también se puede aplicar a otros tejidos, modelos de organoides y sistemas de cultivo celular, además de los hepatocitos. Los usuarios primerizos pueden encontrar que la seccionamiento en serie y la recogida son un desafío sin pérdida. Se recomienda ser competente en la sección ultradelgada regular antes de aplicar este protocolo a una muestra preciosa.Comience recortando cuidadosamente el tejido incrustado en resina con una cuchilla de afeitar con la muestra bloqueada en el adaptador de recorte. Transfiera el arca del espécimen junto con el mandril y la muestra al brazo del espécimen del microtomo y coloque el arca del espécimen de modo que el rango de viaje del arca se extienda de arriba a abajo. Coloque y bloquee el cuchillo de diamante en el soporte del cuchillo, asegurándose de que el ángulo de corte del cuchillo esté ajustado adecuadamente.Bloquee el soporte del cuchillo en el escenario de forma segura. Apague la iluminación descendente del escenario, encienda la iluminación ascendente del escenario, mueva con precaución el cuchillo hacia la muestra, ajustando continuamente el ángulo lateral del cuchillo, la inclinación de la muestra y la rotación de la muestra ajustando las perillas relevantes hasta que la cara del bloque esté alineada con el filo del cuchillo. Coloque la parte superior e inferior de la ventana de corte del brazo de la muestra y deje la muestra justo debajo del filo del cuchillo.Llene el bote del cuchillo con agua limpia y doble destilada y asegúrese de que la superficie del agua esté nivelada con el filo del cuchillo y ligeramente cóncava. Luego, comience a cortar secciones. Detenga el corte justo después de que la muestra haya pasado el filo del cuchillo.Utilice una cuadrícula de ranura vacía para estimar el número de secciones que se van a recopilar en cada cuadrícula. Usando una pestaña en cada mano, rompa suavemente la cinta en cintas más pequeñas que puedan caber en la longitud de la rejilla de la ranura. Haga una nota mental de sus posiciones relativas dentro de la muestra.Usando una varilla aplicadora de vidrio, coloque una gota de cloroformo sobre las secciones para aplanarlas. Tome la primera rejilla de ranura vacía con las primeras pinzas numeradas y sumérjala suavemente en el Tritón X-100 y luego dos veces en el agua destilada. Use un trozo de papel de filtro para eliminar el exceso de agua del borde de las pinzas.Usando fórceps, baje suavemente aproximadamente 2/3 de la rejilla de ranura recubierta de formvar en el agua del bote de cuchillos. Asegúrese de que el lado formvar esté hacia abajo y que el borde largo de la mano derecha de la ranura esté en la superficie del agua y paralelo al borde del agua. Mueva suavemente la rejilla en el agua hacia las cintas para que en el golpe de retorno, las secciones se desvíen hacia la rejilla.Continúe haciendo esto en ondulaciones cada vez más pequeñas, hasta que el borde derecho de la cinta se alinee con el borde derecho de la ranura. Luego, con el último waft, suba suavemente la rejilla para recoger las secciones en la rejilla de la ranura. Coloque varios gránulos de hidróxido de sodio debajo de la tapa de una placa de Petri para proporcionar un ambiente libre de dióxido de carbono.Luego, pipetee cuidadosamente gotas de 40 microlitros del citrato de plomo de Reynold en la parapelícula, una gota por cada rejilla. Invierta cada rejilla en la gota de citrato de plomo y déjela protegida por la tapa de la placa de Petri durante 7 a 10 minutos. Mientras las rejillas se tiñen, coloque cinco gotas de agua destilada de aproximadamente 300 microlitros para cada rejilla en la parapelícula.Al final de la incubación del citrato de plomo, transfiera cada rejilla a una gota de agua destilada para lavar durante un minuto sin respirar directamente en las rejillas. Repita esto cuatro veces más. Use pinzas cruzadas numeradas para recoger la primera rejilla.Toque el borde de la rejilla para filtrar el papel para absorber la mayor parte del agua y dejar secar en las pinzas durante al menos 20 minutos. Repita esto para cada cuadrícula. Con un aumento bajo, observe el orden, la ubicación y la posición de las secciones en serie.Desplácese hasta la sección central de la serie en la cuadrícula. Examine la muestra e identifique una región de interés. Luego, observe la muestra en el aumento deseado.Considere la posibilidad de recopilar la serie con un aumento ligeramente menor, ya que las secciones a menudo no están perfectamente alineadas y es posible que las imágenes deban recortarse más tarde. A continuación, tome imágenes de referencia con aumentos más bajos. Esto ayudará a apreciar el contexto de la región de interés, su ubicación aproximada a diferentes aumentos en relación con los límites de la sección y las características de referencia dentro de la muestra.Utilícelos para indicar la región de interés en otras secciones. Para hacer referencia a la pantalla, use masilla adhesiva reutilizable, pegatinas o un trozo de papel de retroproyector pegado a la pantalla para colocar marcadores temporales en la pantalla. Esto permitirá la reimaginación rutinaria de las mismas características de la región de interés en el centro de la imagen en todo el conjunto de datos.Abra la pila de imágenes, especifique las medidas del vóxel y seleccione la pestaña Segmentación para iniciar la segmentación. Haga clic en Nuevo en el panel del editor de segmentación para definir nuevos objetos en la lista de materiales. Haga clic con el botón derecho para cambiar el color del objeto y haga doble clic para cambiar el nombre del objeto.Para la segmentación manual, elija la herramienta de segmentación debajo de la lista de materiales y seleccione la herramienta de pincel predeterminada para resaltar los píxeles. La imagen de microscopía electrónica de dos hepatocitos opuestos se muestra aquí. La imagen de mayor aumento permite la observación de los detalles morfológicos de los diferentes orgánulos con resolución nanométrica.La imagen representativa muestra la versión segmentada del mismo tomograma, el rastro del retículo endoplásmico, las mitocondrias y los contactos intermembrana entre la sala de emergencias y las mitocondrias de diferentes espacios se muestran aquí. La imagen representativa muestra un ortocorte inclinado superpuesto con trazas de segmentación y su posición relativa dentro de toda la mitocondria. Aquí se muestra la reconstrucción 3D de los orgánulos segmentados y los contactos endoplásmicos retículo-mitocondria en diferentes ángulos.Como este protocolo es compatible con la tomografía basculante cuando se necesita una resolución Z muy alta, ayuda a resolver estructuras pequeñas o enrevesadas. Esta técnica es perfecta para la evaluación inicial de la relación espacial entre diferentes orgánulos y, por lo tanto, particularmente útil en el campo progresivo de los contactos de membrana en la homeostasis de membrana.

three-dimensional-characterization-interorganelle-contact-sites

Caracterización tridimensional de sitios de contacto interorgánicos en hepatocitos mediante microscopía electrónica de sección serie

Abstract