Organische eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen voor robuuste proteoomzuivering vóór massaspectrometrie

Het huidige protocol beschrijft eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen onder gecontroleerde omstandigheden voor robuust en snel herstel en zuivering van proteoommonsters voorafgaand aan massaspectrometrie.

Hoewel meerdere ontwikkelingen in massaspectrometrie (MS) -instrumenten de kwalitatieve en kwantitatieve proteoomanalyse hebben verbeterd, zijn betrouwbaardere front-endbenaderingen om eiwitten te isoleren, verrijken en verwerken vóór MS van cruciaal belang voor succesvolle proteoomkarakterisering. Lage, inconsistente eiwitterugwinning en resterende onzuiverheden zoals oppervlakteactieve stoffen zijn schadelijk voor MS-analyse. Eiwitprecipitatie wordt vaak als onbetrouwbaar, tijdrovend en technisch uitdagend beschouwd om uit te voeren in vergelijking met andere monstervoorbereidingsstrategieën. Deze zorgen worden overwonnen door gebruik te maken van optimale eiwitprecipitatieprotocollen. Voor acetonprecipitatie is de combinatie van specifieke zouten, temperatuurregeling, oplosmiddelsamenstelling en precipitatietijd van cruciaal belang, terwijl de efficiëntie van chloroform / methanol / waterprecipitatie afhankelijk is van de juiste pipettering en flaconmanipulatie. Als alternatief zijn deze neerslagprotocollen gestroomlijnd en semi-geautomatiseerd in een wegwerpspincartridge. De verwachte resultaten van eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen in het conventionele formaat en met behulp van een wegwerp-, tweetrapsfiltratie- en extractiepatroon worden in dit werk geïllustreerd. Dit omvat de gedetailleerde karakterisering van proteomische mengsels door bottom-up LC-MS/MS-analyse. De superieure prestaties van sds-gebaseerde workflows worden ook aangetoond ten opzichte van niet-verontreinigde eiwitten.

Proteoomanalyse door massaspectrometrie is steeds rigoureuzer geworden, vanwege de verbeterde gevoeligheid, resolutie, scansnelheid en veelzijdigheid van moderne MS-instrumenten. Ms-vooruitgang draagt bij aan een grotere efficiëntie van eiwitidentificatie en nauwkeuriger kwantificering 1,2,3,4,5. Met verbeterde MS-instrumentatie eisen onderzoekers een overeenkomstig consistente front-end monstervoorbereidingsstrategie die in staat is tot kwantitatief herstel van zeer zuivere eiwitten in minimale tijd in al....

1. Materiaaloverwegingen en monstervoorbereiding

1. Gebruik alleen oplosmiddelen met een hoge zuiverheidsgraad (aceton, chloroform, methanol) (>99,5%) en chemicaliën, vrij van overtollig vocht.
2. Bereid natriumchloride- en zinksulfaatoplossingen (1 M) in water.
   OPMERKING: Zoutoplossingen kunnen voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard, zolang ze vrij zijn van verontreiniging of microbiële groei.
3. Gebruik de kleinste polypropyleen (PP) microcentrifugeflacon die.......

Figuur 4 geeft een overzicht van de verwachte SDS-uitputting na injectieflacongebaseerde of patroongefaciliteerde precipitatie van eiwitten in een wegwerpfilterpatroon met behulp van aceton. Conventionele nachtelijke incubatie (-20 °C) in aceton wordt vergeleken met het snelle acetonprecipitatieprotocol bij kamertemperatuur (stap 2), evenals CMW-neerslag (stap 4). Residueel SDS werd gekwantificeerd door de methyleenblauwactieve stoffen (MBAS) assay²⁹. In het kort wer.......

Optimale MS-karakterisering wordt bereikt wanneer het resterende SDS onder 10 ppm wordt uitgeput. Terwijl alternatieve benaderingen, zoals FASP en on-bead digestion, kwantitatieve SDS-uitputting bieden met variabel herstel 31,32,33, is het primaire doel van neerslag om de zuiverheid en opbrengst tegelijkertijd te maximaliseren. Dit hangt af van het effectief isoleren van het supernatant (dat de SDS bevat) zonder de eiwitkorrel t.......

Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. De auteurs bedanken Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) en SPARC BioCentre (Molecular Analysis) van het Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) voor hun bijdragen aan de verwerving van MS-gegevens.