* These authors contributed equally
מודל איסכמיה-רפרפוזיה שריר הלב של לב חולדה משופר על ידי שימוש ב- retractor מתוצרת עצמית, צינור פוליוויניל כלוריד ושיטת קשר ייחודית. אלקטרוקרדיוגרמה, טריפנילטרזוליום כלוריד וכתמים היסטולוגיים, ותוצאות ניתוח הישרדות באחוזים הראו כי לקבוצת המודל המשופרת יש שיעורי הצלחה והישרדות גבוהים יותר מאשר לקבוצת המודל הקיימת כבר.
איסכמיה שריר הלב ופגיעה ברפרפוזיה (MIRI), המושרה על ידי מחלת לב כלילית (CHD), גורמת נזק לקרדיומיוציטים. יתר על כן, עדויות מצביעות על כך שטיפול טרומבוליטי או התערבות כלילית מלעורית ראשונית (PPCI) אינם מונעים פגיעה ברפרפוזיה. עדיין אין מודל חייתי אידיאלי עבור MIRI. מחקר זה נועד לשפר את מודל MIRI בחולדות כדי להפוך את הניתוח לקל יותר ובר ביצועי יותר. שיטה ייחודית להקמת MIRI מפותחת על ידי שימוש בצינור רך במהלך שלב מפתח של התקופה האיסכמית. כדי לחקור את השיטה הזו, שלושים חולדות חולקו באופן אקראי לשלוש קבוצות: קבוצת שאם (n = 10); קבוצת מודל ניסיוני (n = 10); וקבוצת מודל קיימת (n = 10). ממצאים של צביעת טריפנילטרזוליום כלוריד, אלקטרוקרדיוגרפיה ואחוז הישרדות מושווים כדי לקבוע את הדיוקים ושיעורי ההישרדות של הניתוחים. בהתבסס על תוצאות המחקר, הוסק כי שיטת הניתוח המשופרת קשורה לשיעור הישרדות גבוה יותר, מקטע ST-T גבוה יותר וגודל אוטם גדול יותר, אשר צפוי לחקות את הפתולוגיה של MIRI טוב יותר.
מחלות לב איסכמיות הן הגורם המוביל לתמותה ברחבי העולם. לתמותה קרדיווסקולרית יש תפקיד מכריע בבריאות הציבור ובאפידמיולוגיה ברחבי העולם1. איסכמיה שריר הלב ופציעת רפרפוזיה ממלאים תפקידים חיוניים במחלת לב איסכמית, המתייחסת לתהליך פתופיזיולוגי מורכב הכולל דלדול של אדנוזין טריפוספט2, ייצור מופרז של מיני חמצן תגובתי3, תגובות דלקתיות4, ותפקוד לקוי של המיטוכונדריה עקב עומס יתר של סידן5, המפעיל אוטם שריר הלב חריף באמצעות תפקוד מטבולי ונזק מבני6.
עם זאת, המנגנונים המפורטים העומדים בבסיס איסכמיה שריר הלב ופציעת רפרפוזיה (MIRI) עדיין אינם ידועים. העבודה הנוכחית נועדה לפתח מודל חייתי ייחודי המדמה כראוי את ההצגה הקלינית והטיפול ב-MIRI. אחרת, בתהליך של מחקר מודל MIRI, בעלי חיים גדולים7 (כגון חזירים) דורשים ניתוח התערבותי, וזה יקר. בעלי חיים קטנים (כגון ארנבות8, עכברים 9,10,11,12 וחולדות 13) זקוקים לניתוח עדין תחת מיקרוסקופיה10, שקים נשלטים מרחוק 8,11, או סחיטת הלב מתוך חלל 9, הדורשת רמה גבוהה של טכנולוגיה ועלולה לגרום למספר סיבוכים לאחר הניתוח המפריעים לדיוק הממצאים. מודל MIRI אידיאלי עם שיעור הישרדות גבוה יותר ועלות נמוכה יותר ימלא תפקיד מכריע במחקר פתולוגי.
מחקר זה נועד להילחם בסוגיות אלה על ידי הקמת מודל נגיש וישים יותר של MIRI בחולדות כדי להקל על המחקר על הפתולוגיה של MIRI, אשר יכול להוביל לגילוי של טיפולים קליניים עבור MIRI.
המחקר אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה סינית (אישור מס ' 202004A002). המחקר פעל בקפדנות על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) בנוגע לשימוש בחיות מעבדה (פרסום NIH מס '85-23, מתוקן 2011). שלושים חולדות ספראג-דאולי זכרות (משקל, 300 ± 50 גרם; גיל, 12 ± 14 שבועות) שימשו בעבודה זו.
1. הכנת בעלי חיים
2. הליך ניתוח
3. הערכה של צביעת טריפנילטרזוליום כלוריד
4. צביעה היסטולוגית
5. הערכת א.ק.ג.
6. ניתוח סטטיסטי
צביעת TTC
מקטעי לב של חולדות שעברו את הליך MIRI הקיים או המשופר או ניתוח הבושה הוכתמו ב-TTC, והתמונות אוחסנו באופן דיגיטלי ונותחו באמצעות ImageJ. חולדות שעברו את נהלי MIRI שכבר היו קיימים או משופרים סבלו מאוטם שריר הלב, בעוד שחולדות מקבוצת ה-sham לא עשו זאת (איור 2B). בהשוואה לחולדות בקבוצת ה-sham, לחולדות בקבוצות המודל הקיימות (p < 0.0001) ובניסוי (p < 0.0001) בקבוצות המודל של MIRI היה הבדל משמעותי בגודל האוטם שריר הלב, ולקבוצת המודל הניסויית היה גודל אוטם שריר הלב גדול יותר מאשר לקבוצת המודל הקיימת (p = 0.0176) (איור 3B).
כתמים היסטולוגיים
ניתוח של דגימות שהוכתמו באמצעות כתמי H&E ו-Masson22,23 הראה כי בהשוואה לקבוצת ה-sham, הקרדיומיוציטים הן של קבוצת הניסוי והן של קבוצות המודל הקיימות חוו נזק קריטי ונוקליאוליזה והסתננו על ידי נויטרופילים רבים (איור 3).
בדיקת א.ק.ג.
מקטעי האק"ג ST-T של חולדות בקבוצות המודל הקיימות והניסיוניות של MIRI היו גבוהים בהשוואה לאלה של חולדות בקבוצת ה-sham (איור 4A), וההבדלים בין המודל הניסיוני לבין קבוצות ה-sham (p < 0.0001) או בין המודל הקיים לבין קבוצות ה-sham (עמ' < 0.0001) היו משמעותיים (איור 4B). יתר על כן, מקטע ST-T היה גבוה יותר בקבוצת המודל הניסיוני מאשר בקבוצת המודל הקיימת (p = 0.0274) (איור 4C).
אחוזי הישרדות
שיעור ההישרדות היה שונה באופן משמעותי בין שתי קבוצות המודל של MIRI (איור 4D). ארבע מתוך עשר החולדות מתו בקבוצת המודל הקיימת. שיעור התמותה היה 40% בתקופת הרפרפוזיה. לעומת זאת, אף אחת מהחולדות בקבוצת המודל הניסויי לא מתה במהלך הניתוח, מה שמדגים כי למודל המשופר הנוכחי היה שיעור הישרדות גבוה יותר (p = 0.0291).
איור 1: שלבים מרכזיים בניתוח המודל של איסכמיות בשריר הלב ופציעת רפרפוזיה (MIRI). נקודות ירוקות מציינות את פרוטוקול הליגטורה בתקופה האיסכמית, כולל הנחת הצינור הרך על העורקים הכליליים (A), חיבור קו התפר לחריץ של הצינור הרך שהוכן מראש (B), שחרור ההחלקה והסרת הצינור הרך עם תחילת תקופת הרפרפוזיה (סרגל קנה מידה = 1 ס"מ) (C ). LAA: תוספת פרוזדורים שמאליים, RAA: תוספת פרוזדורים ימנית, LAD: עורק קדמי שמאלי יורד, RCA: עורק כלילי ימני, IVC: Vena Cava נחות, SVC: קאווה ורידים עליונים, AO: עורק אבי העורקים, PA: עורק ריאתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: כל הליך הניתוח וההבדלים בכתמי טריפנילטרזוליום כלוריד (TTC) בין קבוצות שונות. המחזיר הקטן שהוכן מראש (סרגל קנה מידה = 15 מ"מ), צינור רך (סרגל קנה מידה = 10 מ"מ), והניתוח כולו (סרגל קנה מידה = 15 מ"מ) מוצגים (A). שלושים חולדות חולקו באופן אקראי לקבוצות הניסוי (n = 10), קבוצת sham (n = 10) והמודל הקיים (n = 10). צביעת TTC הצביעה על כך שגם בקבוצות הניסוי וגם בקבוצות המודלים הקיימות היו שינויים משמעותיים בהשוואה לקבוצת ה-sham (B). הדופן הקדמית של שריר הלב בניסוי והדופן הצדדית בקבוצות המודל הקיימות הפכו ללבן חיוור, ואישרו את מיקומו של האזור האיסכמי (סרגל קנה מידה = 5 מ"מ). "המודל הקיים" מתואר כ"מודל הישן" באיור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הבדלים בכתמי H&E ו-Masson בין קבוצות. שלושים חולדות ספראג דאולי זכריות חולקו באופן אקראי לקבוצות הניסוי (n = 10), קבוצת sham (n = 10) והמודל הקיים (n = 10), וההשוואה בין השינויים המורפולוגיים בתאים בין קבוצות מוצגת (סרגל קנה מידה = 2 מ"מ). המטוקסילין ואוסין (H&E) וצביעת מאסון מראים כי לתאי שריר הלב של המודל הניסיוני ולקבוצות המודל הקיימות יש נזק קריטי, נוקליאוליזה, והם מסתננים על ידי נויטרופילים רבים בהשוואה לאלה של קבוצת ה-sham (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). "המודל הקיים" מתואר כ"מודל הישן" באיור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
תרשים 4: הבדלים בתוצאות סטטיסטיות בין קבוצות. שלושים חולדות ספראג דאולי זכריות חולקו באופן אקראי לקבוצות הניסוי (n = 10), קבוצת sham (n = 10) והמודל הקיים (n = 10). ממצאי אלקטרוקרדיוגרמה מראים כי בהשוואה לקבוצת המודלים הקיימת, לקבוצת המודל הניסויי יש גודל אוטם שריר הלב גדול יותר (****p < 0.0001, *p = 0.0176) (A), גובה מקטע ST גבוה יותר (****p < 0.0001, *p = 0.0274) (B) ואחוז הישרדות גבוה יותר (p = 0.0291) (C ). במיוחד, חולדות מקבוצת המודל הקיימת היו בסיכון גבוה יותר למות בתחילת תקופת האיסכמיה ובתחילת תקופת הרפרפוזיה (D). "המודל הקיים" מתואר כ"מודל הישן" באיור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: הפרטים של המחזיר המוכן מראש וצינור ה-PVC. מוצגות ה-retractor (A) המוכנות מראש וצינור ה-PVC (B). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
ההבדל העיקרי בין השיטות הקיימות כבר לבין השיטות המשופרות היה השימוש בצינורות PVC בתהליך ההצמדה. בשיטת הניתוח הקיימת, רקמת שריר הלב נקשרה באמצעות תפר משי 6-0 בלבד, מה שגרם נזק לשריר הלב במהלך קשירת וכתוצאה מכך למוות תוך ניתוחי. יתר על כן, הפעימה של הלב תשחרר את ההחלקה. לעומת זאת, בשיטה המשופרת עם צינור ה-PVC, ניתן היה להדק את ההחלקה שהונחה בחריץ של הצינור, ולהגדיל את שטח שריר הלב המושפע מהקשירה. יתרונות אלה נצפו במהלך ההליך הניסיוני ואושרו על ידי צביעת TTC וממצאי ההישרדות באחוזים.
השלב הקריטי של שיטת הניתוח המשופרת היה הנחת הצינור הרך על העורק הכלילי הפרוקסימלי LAD, מלווה בעצבים, כלי הלימפה ורקמת שריר הלב במהלך קשירת התקופה האיסכמית. צינור רך מוכן מראש זה יכול לשמש כרית המגנה על הרקמות ההיקפיות (עצבים, מיוקרדיה וכלי הלימפה) ומפחיתה את התמותה במהלך קשירת עורקים כליליים. הניתוח שבוצע בשיטה הקיימת כבר היה דומה לניתוח לאוטם שריר הלב. ממצאי ההישרדות באחוזים הצביעו על כך שחולדות בקבוצת המודל הקיימת מתו בעיקר בתקופה האיסכמית (שתי חולדות מתו ב-2 דקות לאחר ההדבקה, ושתי חולדות מתו ב-45 דקות לאחר ההצמדה). אחרת, הסיבות הבסיסיות למוות עדיין אינן ברורות, וישנן שורה של השערות, כולל נזק נוסף למבני העצבים23, כלי הלימפה והמיוקרדיה.
לגבי פגיעה עצבית, מחקרים קודמים הצביעו על כך שבמהלך התקופה האיסכמית במודל החי, מלבד ההשפעות המקומיות הישירות של איסכמיה על מבני העצבים, יש גם כנראה ירידה משמעותית ברמות הנוירופפטיד Y (NPY) התורמות להפרעות בהובלה אקסופלסמית בעצבנות הסימפתטית24. ממצא זה מסכים עם התוצאות שדווחו על ידי Han et al.25, שגילו כי היעלמות הדרגתית של NPY התרחשה בתוך שריר הלב האוטם לאחר קשירת העורק הכלילי LAD בחולדות. עם זאת, תפקידו של NPY בהקשר זה עדיין אינו ברור. מחיקתו מחלישה תפקוד לקוי של הלב ואפופטוזיס במהלך אוטם שריר הלבהחריף 26, והיא קשורה להפרעת קצב27, לחץ דם גבוה ותפקוד מיקרו-וסקולרי כלילי28.
יתר על כן, חסימה שלילית של זרימת הלימפה הלבבית התרחשה במהלך התקופה האיסכמית, מה שהוביל לבצקת לב קשה, תפקוד לקוי שמאלי ודימומים29, אשר עשויים להיות גורם נוסף למוות בחולדות. במהלך תהליך פתולוגי זה, ניתן לייחס את הליגטורה של העורק הכלילי LAD לחסימה של עורקים כליליים או הובלה לימפתית לבבית בתוך אזור האוטם, אשר יכול לגרום לסיבוכים נוספים, כגון שיפוץ שלילי של הלימפה של אספן אפיקרדיאלי, זרימת הלימפה מופחתת, ובצקת מתמשכת30.
לכן, זרימת הדם בכלי הלימפה ממלאת תפקיד פונקציונלי בהומאוסטזיס לבבי31 ובריפויפצעים 32, וממצאי ההישרדות באחוזים במחקר זה מצביעים על כך שההליך הכירורגי המשופר של MIRI עשוי למנוע נזק לימפטי ולקדם רפרפוזיה לימפטית על ידי הנחת הצינור הרך על העורק הכלילי LAD במהלך הליגטורה. לשם השוואה, שיטת הניתוח הקיימת נוטה יותר לקרוע את שריר הלב ולגרום לדימום מסיבי במהלך קשירת העורק הכלילי LAD, ללא אפקט הריפוד של הצינור הרך. בנוסף, קוטר הצינור הרך שהוכן מראש היה גדול בהרבה מתופר המשי 6-0, וייתכן שהצינור התכווץ וגרם לגודל אוטם גדול יותר כאשר ההחלקה נקשרה לצינור במהלך התקופה האיסכמית.
למחקר זה היו כמה מגבלות. גודל האוטם של הלב נותח בניסוי הראשוני. נוסחת ההחלפה (N = 7.75) חושבה באמצעות משוואה33 שדווחה בעבר. בהתחשב במוות אפשרי של חולדות במהלך הניתוח, N הועלה ב -25%; לפיכך, n = 10 (עשר חולדות לכל קבוצה) הוחלט. אחרת, בשיטה הקיימת כבר ליצירת מודל MIRI היה שיעור תמותה גבוה. לכן, מקרים מעטים (גודל מדגם נמוך) בקבוצת המודל הניסויי השפיעו על הממצאים הסטטיסטיים. מספר הערכות, כולל אקוקרדיוגרפיה30, צביעה כחולה של אוונס34 ומדידת אנזים שריר הלב35, היו חיוניות להערכה ולניתוח של תפקוד הלב. בשל גודל המדגם הנמוך של עבודה זו, הערכות אלה לא בוצעו ויתואר במחקר עתידי של מחקר פרמקודינמי ב- MIRI. עם זאת, בהתחשב בכך שההליך הכירורגי הקיים ליצירת מודל MIRI קשור לנזק נרחב בשריר הלב, כדאי לדווח על שיטה נוכחית זו כדי לשפר את המידול של MIRI בחולדות ולהביא אור למודל פרה-קליני זה המדמה נכונה מחלת לב איסכמית.
לסיכום, לשיטת הניתוח המשופרת ליצירת מודל MIRI היה שיעור הישרדות גבוה יותר, סגמנט ST-T גבוה יותר וגודל אוטם גדול יותר משיטת יצירת מודל MIRI הקיימת, מה שמרמז על כך שהמודל המשופר מדמה טוב יותר את הפתולוגיה של MIRI.
למחברים אין מה לחשוף.
עבודה זו נתמכה על ידי מנהל הרפואה הסינית המסורתית [SLJ0204], בית החולים המחוזי ג'יאנגסו לרפואה סינית (Y21017), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [81973763, 81973824,82004239].
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Neutral Formalin | Chunyu, China | _ | |
2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride | Solarbio, China | T8107 | |
75% Alchol | SCR, China | 10009261 | |
Artery Clip | Zhonglin Dongsheng, China | 6.5cm | |
Camera | Olympus Corporation, Japan | EPL5 | |
Cotton ball | Huachen, China | _ | |
Dpilatory cream | Veet, China | _ | |
Eye speculum | Shanghai Jingzhong, China | _ | |
Gauze | Zhonggan, China | _ | |
GraphPad | GraphPad Software, USA | 8.0 | |
H&E Kit | Solarbio, China | G1120 | |
High-pressure steam sterilizer | TOMY, Japan | SX-500 | |
ImageJ | NIH, USA | _ | |
Masson Kit | Solarbio, China | G1340 | |
Medical Tape | Mr.Song, China | _ | |
Microscope | Olympus Corporation, Japan | CKX31 | |
Microscopy | TEKSQRAY, China | _ | |
Microtome | Leica, Germany | RM2235 | |
Microtome Blade | Leica, Germany | 819 | |
Needle holder | Shanghai Jingzhong, China | _ | |
Ophthalmic scissors | Shanghai Jingzhong, China | _ | |
Ophthalmic tweezers | Shanghai Jingzhong, China | _ | |
Paper clip | Chenguang, China | ABS91613 | |
Physiological saline solution | Kelun, China | _ | |
Powerlab ECG | ADINSTRUMENTS ,China | 4/35 | |
PVC tube | Guanzhijia, China | _ | |
Small animal ventilator | TECHMAN, China | HX-101E | |
Sodium Pentobarbital | SIGEMA, USA | 1030001 | |
Suction trocar | TECHMAN, China | HX-101E | |
Suture line | Lingqiao, China | 4-0 | |
Suture needle with thread | Shanghai Pudong Jinhua Medical Products Co LTD, China | 6-0 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved