200KV透過型電子顕微鏡を用いた高分解能クライオEMデータセットのルーチンコレクション

クライオ電子顕微鏡(クライオEM)は、過去10年間にタンパク質構造決定の日常的な方法として確立され、公表された構造データのシェアは増え続けています。TEM技術と自動化の最近の進歩により、データ収集の速度と取得した画像の品質の両方が向上すると同時に、3 Å未満の解像度でクライオEMマップを取得するために必要な専門知識レベルが低下しています。このような高分解能構造のほとんどは、最先端の300kVクライオTEMシステムを使用して得られていますが、特にエネルギーフィルタを装備している場合、200kVクライオTEMシステムでも高分解能構造を得ることができます。さらに、リアルタイムの画質評価による顕微鏡アライメントとデータ収集の自動化により、システムの複雑さが軽減され、最適な顕微鏡設定が保証されるため、高品質の画像の収率とデータ収集の全体的なスループットが向上します。このプロトコルは、200kVのクライオ透過型電子顕微鏡に最近の技術的進歩と自動化機能を実装することを示し、 de novo 原子モデルの構築に十分な3Dマップの再構築のためのデータを収集する方法を示しています。このような高解像度のクライオEMデータセットの日常的な収集を可能にするために考慮する必要があるベストプラクティス、重要な変数、および一般的な問題に焦点を当てています。特に、i)顕微鏡アライメントの自動化、ii)データ収集に適した領域の選択、iii)高品質で高スループットのデータ収集に最適な光学パラメータ、iv)ゼロロスイメージングのためのエネルギーフィルタチューニング、v)データ管理と品質評価。エネルギーフィルターと直接電子検出器を備えた200kV TEMを使用して2.1-Åの分解能に再構築されたアポフェリチンと、エネルギーフィルターと直接電子検出器を備えた2.1-Åの分解能に再構築された サーモプラズマアシドフィラム 20Sプロテアソームの例で、エネルギーフィルターを使用して達成可能な分解能のベストプラクティスの適用と改善が実証されます。