200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

Cryo-electron microscopy (cryo-EM)는 지난 십 년 동안 단백질 구조 결정을위한 일상적인 방법으로 확립되어 출판 된 구조 데이터의 점유율이 계속 증가하고 있습니다. TEM 기술 및 자동화의 최근 발전으로 데이터 수집 속도와 획득 이미지의 품질이 향상되는 동시에 하위 3 Å 해상도에서 cryo-EM 맵을 얻는 데 필요한 전문 지식 수준이 감소했습니다. 이러한 고해상도 구조의 대부분은 최첨단 300kV cryo-TEM 시스템을 사용하여 얻어졌지만 특히 에너지 필터가 장착 된 경우 200kV cryo-TEM 시스템으로 고해상도 구조를 얻을 수 있습니다. 또한 실시간 이미지 품질 평가를 통해 현미경 정렬 및 데이터 수집을 자동화하면 시스템의 복잡성이 줄어들고 최적의 현미경 설정이 보장되므로 고품질 이미지의 수율과 데이터 수집의 전반적인 처리량이 증가합니다. 이 프로토콜은 200kV 냉동 투과 전자 현미경에서 최근의 기술 진보 및 자동화 기능의 구현을 시연하고 de novo 원자 모델 구축에 충분한 3D 맵의 재구성을 위한 데이터를 수집하는 방법을 보여줍니다. 우리는 모범 사례, 중요한 변수 및 이러한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집을 가능하게하기 위해 고려해야 할 일반적인 문제에 중점을 둡니다. 특히 i) 현미경 정렬 자동화, ii) 데이터 수집에 적합한 영역 선택, iii) 고품질의 고처리량 데이터 수집을 위한 최적의 광학 파라미터, iv) 제로 손실 이미징을 위한 에너지 필터 튜닝, v) 데이터 관리 및 품질 평가와 같은 필수 주제가 자세히 검토됩니다. 에너지 필터를 이용한 모범 사례의 적용 및 달성 가능한 분해능의 개선은 에너지 필터 및 직접 전자 검출기가 장착된 200kV TEM을 사용하여 2.1-Å 분해능으로 재구성된 1.6 Å 및 2.1-Å 분해능으로 재구성된 Thermoplasma acidophilum 20S 프로테아좀의 예에서 입증될 것이다.