200 KV İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-EM Veri Kümelerinin Rutin Toplanması

Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM), son on yılda protein yapı tayini için rutin bir yöntem olarak kurulmuş ve yayınlanan yapısal verilerin giderek artan bir payını almıştır. TEM teknolojisindeki ve otomasyondaki son gelişmeler, hem veri toplama hızını hem de elde edilen görüntülerin kalitesini artırırken, aynı zamanda 3 şaltı çözünürlüklerde kriyo-EM haritaları elde etmek için gerekli uzmanlık seviyesini azaltmıştır. Bu tür yüksek çözünürlüklü yapıların çoğu son teknoloji ürünü 300 kV kriyo-TEM sistemleri kullanılarak elde edilirken, özellikle bir enerji filtresi ile donatıldığında 200 kV kriyo-TEM sistemleri ile yüksek çözünürlüklü yapılar da elde edilebilir. Ek olarak, mikroskop hizalamalarının ve veri toplamanın gerçek zamanlı görüntü kalitesi değerlendirmesi ile otomasyonu, sistem karmaşıklığını azaltır ve optimum mikroskop ayarlarını garanti eder, bu da yüksek kaliteli görüntülerin veriminin ve veri toplamanın genel veriminin artmasına neden olur. Bu protokol, 200 kV'luk bir kriyo-transmisyonlu elektron mikroskobu üzerinde son teknolojik gelişmelerin ve otomasyon özelliklerinin uygulanmasını ve de novo atomik model oluşturma için yeterli olan 3D haritaların yeniden yapılandırılması için verilerin nasıl toplanacağını göstermektedir. Bu tür yüksek çözünürlüklü kriyo-EM veri kümelerinin rutin olarak toplanmasını sağlamak için göz önünde bulundurulması gereken en iyi uygulamalara, kritik değişkenlere ve yaygın sorunlara odaklanıyoruz. Özellikle aşağıdaki temel konular ayrıntılı olarak gözden geçirilmiştir: i) mikroskop hizalamalarının otomasyonu, ii) veri toplama için uygun alanların seçimi, iii) yüksek kaliteli, yüksek verimli veri toplama için optimum optik parametreler, iv) sıfır kayıplı görüntüleme için enerji filtresi ayarı ve v) veri yönetimi ve kalite değerlendirmesi. En iyi uygulamaların uygulanması ve bir enerji filtresi kullanılarak ulaşılabilir çözünürlüğün iyileştirilmesi, 1.6 Å'ye yeniden yapılandırılmış apo-ferritin ve bir enerji filtresi ve bir doğrudan elektron dedektörü ile donatılmış 200 kV'luk bir TEM kullanılarak 2.1-şçözünürlüğe yeniden yapılandırılmış Thermoplasma acidophilum 20S proteazom örneğinde gösterilecektir.