Utvärdering av substrat Ubiquitylation av E3 Ubiquitin-ligas i däggdjurscelllysater

Ubiquitylation är en post-translationell modifiering som sker i eukaryota celler som är avgörande för flera biologiska vägars reglering, inklusive cellöverlevnad, proliferation och differentiering. Det är en reversibel process som består av en kovalent bindning av ubiquitin till substratet genom en kaskadreaktion av minst tre olika enzymer, bestående av E1 (Ubiquitin-aktiveringsenzym), E2 (Ubiquitin-konjugerande enzym) och E3 (Ubiquitin-ligasenzym). E3-komplexet spelar en viktig roll i substratigenkänning och allestädes närvarande. Här beskrivs ett protokoll för att utvärdera substrat ubiquitylation i däggdjursceller med hjälp av övergående samtransfektion av en plasmid som kodar för det valda substratet, en E3 ubiquitinligas och en taggad ubiquitin. Före lysen behandlas de transfekterade cellerna med proteasomhämmaren MG132 (karbensoxi-leu-leu-leucinal) för att undvika substratproteasomal nedbrytning. Vidare utsätts cellextraktet för småskalig immunoprecipitation (IP) för att rena det polyubiquitylerade substratet för efterföljande detektion genom western blotting (WB) med användning av specifika antikroppar för ubiquitintagg. Därför beskrivs ett konsekvent och okomplicerat protokoll för ubiquitylationsanalys i däggdjursceller för att hjälpa forskare att ta itu med ubiquitylation av specifika substrat och E3-ubiquitin-ligaser.