Fizyolojik Koşullar Altında Hücre Altı Membran Yeniden Şekillenmesini Araştırmak için Fare Derisinde Nötrofil Migrasyonunun Görüntülenmesi

Dokularda bağışıklık hücresi alımı ve işlevi üzerine yapılan çalışmalar, son yirmi yılda çok aktif bir alan olmuştur. Nötrofiller, iltihaplanma bölgesine ulaşan ve enfeksiyon veya doku hasarı sırasında doğuştan gelen bağışıklık tepkisine katılan ilk bağışıklık hücreleri arasındadır. Şimdiye kadar, nötrofil göçü, tek tip stimülasyona veya agaroz veya mikro-akışkan kanallar altında sınırlı göçe dayalı çeşitli in vitro deneysel sistemler kullanılarak başarılı bir şekilde görselleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu modeller, nötrofillerin in vivo olarak karşılaştığı karmaşık mikro ortamı özetlememektedir. İntravital hücre altı mikroskobu (ISMic) gibi çoklu foton mikroskobu (MPM) tabanlı tekniklerin geliştirilmesi, fizyolojik koşullar altında hücre altı çözünürlüklerde nötrofil dinamiklerini görselleştirmek ve araştırmak için benzersiz bir araç sunar. Özellikle, canlı anestezi uygulanmış bir farenin kulağı, erişilebilirlik kolaylığı ve cerrahi maruziyet eksikliği nedeniyle nötrofil interstisyel göçünü gerçek zamanlı olarak takip etmek için deneysel bir avantaj sağlar. ISMic, hem hücresel hem de daha da önemlisi hücre altı süreçleri zaman içinde 3D (4D) olarak izlemek için gerekli optik çözünürlüğü, hızı ve alım derinliğini sağlar. Ayrıca, interstisyel mikroçevrenin (yani, kan damarları, yerleşik hücreler, hücre dışı matris) çok modlu görüntülemesi, seçilmiş floresan belirteçleri eksprese eden transgenik farelerin, floresan problar aracılığıyla eksojen etiketlemenin, doku içsel floresansının ve ikinci/üçüncü harmonik üretilen sinyallerin bir kombinasyonu kullanılarak kolayca gerçekleştirilebilir. Bu protokol, 1) fare kulağına evlat edinen transfer için nötrofillerin hazırlanmasını, 2) optimal hücre altı görüntüleme için farklı ayarları, 3) fizyolojik bir yanıtı korurken hareket artefaktlarını en aza indirme stratejilerini, 4) ISMic kullanılarak nötrofillerde gözlemlenen zar yeniden şekillenme örneklerini ve 5) in vivo göç eden nötrofillerde zar yeniden şekillenmesinin kantitatif analizi için bir iş akışını açıklar.