Sidoli 연구소는 백혈병 연구 재단 (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck 및 NIH Office of Director (1S10OD030286-01)를 감사하게 생각합니다.

1. 완충제 및 시약의 제조
<ol><li>세포 성장 배지 (HepG2 / C3A 세포 용) : Dulbecco의 변형 이글 배지 (DMEM, 4.5 g / L 포도당 포함)에 태아 소 혈청 (FBS) (10 % v / v), 비 필수 아미노산 (1 % v / v), L- 글루타민 보충제 (1 % v / v) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (0.5 % v / v)을 첨가하십시오. 성장 배지는 최대 2주 동안 4°C에서 저장된다.</li>
	<li>200 mM 소듐 부티레이트(NaBut) 용액: 10 mL를 제조하기 위해, 220.18 m...

히스톤 PTM의 분석은 일반적인 프로테오믹스 분석 파이프라인과 근본적으로 다릅니다. 대부분의 히스톤 PTM은 여전히 수수께끼 같은 생물학적 기능을 가지고 있습니다. 결과적으로 Gene Ontology 또는 pathway 데이터베이스와 같은 주석을 사용할 수 없습니다. 히스톤 변형을 그들의 촉매작용을 담당하는 효소 또는 이들 PTM에 결합하는 도메인을 함유하는 단백질과 연관시키는 몇몇 자원이 존재한다(예를 ...

19세기 후반부터 세포 배양시스템은 인체 1,2 외부의 세포의 성장과 발달을 연구하기 위한 모델로 사용되어 왔다. 그들의 사용은 또한 조직과 기관이 건강한 상황과 병든 맥락에서 어떻게 기능하는지 연구하기 위해 확장되었습니다 1,3. 현탁액 세포 (예를 들어, 혈액 세포)는 페트리 접시 또는 플라스크에서 매끄럽고 상호 교환 가능하게 성장하며, 생체 내에서 3차원 (3D) 구조로 조립되지 않는다. 고체 기관으로부터 유래된 세포는 2차원(2D) 또는 3D 배양 시스템에서 성장할 수 있다. 2D 배양에서, 세포는 평평한 표면 2,4에 부착되는 단층에서 성장한다. 2D 세포 배양 시스템은 지수 성장 및 빠른 배가 시간, 전형적으로 24 h 내지 수일5를 특징으로 한다. 3D 시스템의 세포는 성장하여 조직과 유사한 대기업을 모델링하는 복잡한 세포 - 세포 상호 작용을 형성하며, 배가시키는 시간이 1 개월 또는 그 이상에 도달 할 수있는 동적 평형에 도달 할 수있는 능력을 특징으로합니다5.
이 논문에서 제시된 것은 감소된 중력을 시뮬레이션하는 회전 세포 배양 시스템에서 3D 구상체를 성장시키기 위한 혁신적인 방법론이다6. 이것은 NASA가 1990 년대7에 도입 한 세포 배양 시스템의 단순화 된 유도체입니다. 이 접근법은 회전 플라스크와 같은 기존 방법에서 발생하는 전단력을 최소화하고 스페로이드 재현성을 증가시킵니다6. 또한, 회전 생물반응기는 활성 영양소 확산을 증가시켜 배지 교환이 비실용적 인 매달린 방울 세포 배양과 같은 시스템에서 발생하는 괴사 형성을 최소화합니다6. 이런 식으로, 세포는 대부분 방해받지 않고 성장하여 조직에서 성장하는 세포와 관련된 구조적 및 생리적 특성의 형성을 허용합니다. 이러한 방식으로 배양된 C3A 간세포(HepG2/C3A)는 초구조적 소기관을 가졌을 뿐만 아니라 생체내1,2에서 관찰된 수준에 필적하는 양의 ATP, 아데닐레이트 키나제, 요소 및 콜레스테롤을 생성하였다. 또한, 2D 대 세포 배양 시스템에서 성장한 세포는 .3D이한 유전자 발현 패턴(8)을 나타낸다. 3D 구상체로 성장한 C3A 간세포의 유전자 발현 분석은 이들 세포가 간 기능을 조절하는 주요 경로에 관여하는 유전자뿐만 아니라 광범위한 간 특이적 단백질을 발현한다는 것을 보여주었다8. 이전의 간행물은 2D 배양물에서 기하급수적으로 성장하는 세포의 프로테옴과 3D 스페로이드 배양물에서 동적 평형을 이루는 세포 사이의 차이를 입증했다5. 이러한 차이에는 세포 신진 대사가 포함되며, 이는 차례로 세포의 구조, 기능 및 생리학에 영향을 미칩니다5. 2D 배양물에서 성장한 세포의 프로테옴은 세포 복제에 관여하는 단백질에서 더 풍부해진 반면, 3D 구상체의 프로테옴은 간 기능성에서 더욱 풍부해졌다5.
3D 구상체로 성장한 세포의 느린 복제 속도는 크로마틴 상태 및 변형과 관련된 특정 현상을보다 정확하게 모델링합니다 (예 : 히스톤 클리핑9). 히스톤 클리핑은 히스톤 N 말단 꼬리의 일부의 단백질 분해 절단을 일으키는 비가역적 히스톤 번역 후 변형 (PTM)이다. 그것의 생물학적 기능은 여전히 논의 중이다10,11,12,13, 일차 세포 및 간 조직에서의 그것의 존재는 구상체로 성장한 HepG2 / C3A 세포에 의해 모델링되지만 평평한 세포9는 아닙니다. 이것은 크로마틴 상태 및 변형이 주로 유전자에 대한 접근성을 조절함으로써 DNA 판독을 조절하고 따라서 발현14를 조절하기 때문에 중요합니다. 히스톤 PTM은 히스톤이 조립되는 뉴클레오솜의 순 전하에 영향을 미침으로써 크로마틴 상태에 직접적으로 영향을 미치거나, 크로마틴 작가, 독자 및 지우개(14)를 모집함으로써 간접적으로 영향을 미친다. 현재까지 수백 개의 히스톤 PTM이확인되어 염색질이 DNA16을 해석하기 위해 세포에 의해 사용되는 "히스톤 코드"를 호스팅한다는 가설을 강화했습니다. 그러나, 무수한 PTM 조합(15)의 확인, 및 히스톤 PTM의 조합이 종종 단리된 상태로 존재하는 PTM으로부터 상이한 생물학적 기능을 갖는다는 발견(예를 들어, Fischle, et al.17)은 "히스톤 코드"를 해독하기 위해 더 많은 작업이 필요하다는 것을 강조한다.
현재, 히스톤 PTM 분석은 항체 (예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역형광, 또는 크로마틴 면역침전 후 시퀀싱 [ChIP-seq]) 또는 질량 분광법 (MS)을 이용하는 기술에 기초한다. 항체 기반 기술은 높은 감도를 가지며 히스톤 마크의 게놈 전체 국소화에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있지만 조합 18,19,20에 존재하는 희귀 한 PTM 또는 PTM을 연구하는 데 종종 제한적입니다. MS는 단일 및 공존하는 단백질 변형, 특히 히스톤 단백질 18,19,20의 고처리량 및 편향되지 않은 동정 및 정량화에 더 적합하다. 이러한 이유로, 이것 및 몇몇 다른 실험실은 히스톤 펩티드 (상향식 MS), 무손상 히스톤 꼬리 (중간 다운 MS) 및 전장 히스톤 단백질 (하향식 MS)21,22,23의 분석을 위해 MS 파이프 라인을 최적화했습니다.
아래에 자세히 설명 된 것은 HepG2 / C3A 구상체를 재배하고 탠덤 질량 분광법 (nLC-MS / MS)과 온라인으로 결합 된 나노 액체 크로마토그래피를 통해 히스톤 펩티드 분석 (상향식 MS)을 준비하기위한 워크 플로입니다. 2D 세포 배양물을 성장시키고 세포를 수확하여 생물반응기로 옮겨 구상체를 형성하기 시작했습니다 (그림 1). 배양에서 18일 후, 구상체를 소듐 부티레이트 또는 소듐 숙시네이트로 처리하여 히스톤 아세틸화 및 숙시닐화의 상대적 풍부도를 증가시켰다. 특히, 3D 배양물은 유전성 화합물뿐만 아니라 평평한 배양 등가물로 처리 될 수 있습니다. 사실, 최근의 간행물은 3D 배양물에서 세포의 독성학 반응이 2D 편평한 배양24,25에서의 것보다 일차 조직과 더 유사하다는 것을 강조한다. 그런 다음 세포를 지정된 시점에서 수집하고 핵 분리를 수행했습니다. 그 후, 히스톤을 추출하고 트립신 소화 전후에 Garcia et al.26에 의해 처음 개발된 프로토콜에 따라 프로피온성 무수물로 유도체화하였다. 이 절차는 역상 크로마토그래피 (C18)로 온라인 분리 및 MS로 검출하기에 적합한 크기의 펩티드를 생성한다. 마지막으로, 히스톤 펩티드가 확인되고 정량화되었고, 생성된 데이터는 보다 완전한 생물학적 해석을 위해 여러 가지 방법으로 표현되었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10, 20, 200, and 1000 &#181;L single-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G syringe needle</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>Z740118 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low attachment microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2&#160; U-shaped cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>461464U</td>
			<td>Untreated, with vent cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C (Corning)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td>Acetone should be used cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>10004-12</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control unit</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tablet for ClinoStar settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-205-CV</td>
			<td>1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Mott</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model 7121000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>9&#34;, cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutagro supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td>200 mM L-ananyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>1X solution without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB resin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td>Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30&#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oro-Flex I polypropylene filter plate</td>
			<td>Orochem</td>
			<td>OF1100</td>
			<td>96-well polypropylene filter plate w/ 10 &#181;M PE frit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>0-13 pH test paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 &#181;M ID x 363 &#181;M OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240311-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.0003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#181;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>25477 (American Laboratory Trading)</td>
			<td>Nutator Mixer 1105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>20249 (American Laboratory Trading)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-375</td>
			<td>Baker Analyzed ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC421451000</td>
			<td>Resuspend 100% w/v in HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28904</td>
			<td>Sequencing grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold 96-well</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue

포유동물 세포의 편평한 배양은 세포 생리학을 이해하기 위해 시험관내 접근법으로 널리 사용되지만, 이 시스템은 부자연스럽게 빠른 세포 복제로 인해 고체 조직을 모델링하는데 한계가 있다. 이것은 성숙한 크로마틴을 모델링 할 때 특히 도전적인데, 빠른 복제 세포는 종종 DNA 복제에 관여하고 이질적인 폴리 플로이드 집단을 가지고 있기 때문입니다. 아래는 3차원(3D) 세포 배양 시스템을 사용하여 정동작 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하기 위한 워크플로우입니다. 이 프로토콜을 사용하여, 간세포 암종 세포주는 활성 영양소 확산 및 낮은 전단력을 제공하는 인큐베이터에서 재현 가능한 3D 구상체로 성장한다. 소듐 부티레이트와 소듐 숙시네이트에 의한 처리는 각각 히스톤 아세틸화 및 숙시닐화의 증가를 유도하였다. 히스톤 아세틸화 및 숙시닐화 수준의 증가는 보다 개방된 크로마틴 상태와 연관된다. 그런 다음 구상체는 세포 핵의 분리를 위해 수집되며, 히스톤 단백질은 번역 후 변형의 분석을 위해 추출됩니다. Histone 분석은 탠덤 질량 분광법과 온라인으로 결합 된 액체 크로마토그래피를 통해 수행되고 사내 계산 파이프 라인이 뒤 따릅니다. 마지막으로, 조합 히스톤 마크의 빈도 및 발생을 조사하기 위한 데이터 표현의 예가 도시된다.

이 프로토콜에서, HepG2/C3A 구상체는 20 mM NaBut 및 10 mM NaSuc로 처리되었으며, 둘 다 히스톤 PTM의 글로벌 수준에 영향을 미쳤다 (도 3A). 그런 다음 히스톤 PTM을 MS/MS 수집을 통해 단일 잔기 수준에서 확인하고 정량화하였다(도 3B).
샘플이 반복실험에서 실행될 때, 통계적 분석을 수행하여 샘플 간의 PTM의 폴드 변화 농축과 관찰의 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

이 프로토콜은 입체 세포 배양 시스템이 거의 생리적 인 상태에서 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 설명합니다.

간 조직의 3D 세포 배양 모델에서 히스톤 번역 후 변형의 글로벌 수준 정량화

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

글로벌 크로마틴 역학은 암 및 노화와 같은 여러 질병 상태의 중요한 매개자인 것으로 나타났습니다. 우리의 프로토콜은이 과정을 연구하기위한 생리 학적 관련 모델을 제공합니다. 히스톤 번역 후 변형 또는 PTMS의 표준 실험실 분석은 일반적으로 항체 기반 분석을 사용하여 한 번에 단일 PTM에 대한 프로빙으로 제한됩니다.히스톤 PTMS의 액체 크로마토그래피 질량 분광법 분석을 통해 단일 실험에서 수백 개의 PTMS의 풍부함을 측정 할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 Stephanie Stransky, Ronald Cutler, Julie Kim, postdoc, grad student 및 Research Tech가 각각 실험실에서 나올 것입니다. 첫째, 표준 성장 배지를 사용하여 세포가 80 % 합류 할 때까지 단층으로 성장시킵니다.그런 다음 HBSS로 세포를 세척하십시오. HBSS에 희석 된 0.05 % 트립신 - EDTA 5 밀리리터를 넣으십시오. 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 5분 동안 배양한다.현미경을 사용하여 세포 분리를 확인하십시오. 세포를 계수한 후, 세포 현탁액을 신선한 성장 배지로 희석한다. 0.5 밀리리터의 성장 배지를 추가하여 초저 부착물 24 웰 둥근 바닥 플레이트와 각각 여러 개의 마이크로 웰을 평형화하십시오.그런 다음 플레이트를 3000 x g로 원심분리하여 플레이트의 표면에서 기포를 제거한다. 이제 이전에 만들어진 세포 현탁액을 24-웰 플레이트로 옮기고 120 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 24-웰 플레이트에서 세포를 확인한 다음, 스페로이드 형성을 위해 24시간 동안 5% 이산화탄소로 플레이트를 섭씨 37도에서 인큐베이션한다.한편, 생물 반응기를 평형화하기 위해 25 밀리리터의 멸균수를 습도 챔버에 첨가하고 아홉 밀리리터의 성장 배지를 세포 챔버에 첨가하십시오. 생물반응기를 회전하는 클리노스타트 인큐베이터에서 5% 이산화탄소로 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양한다. 초저 부착 24-웰 플레이트에서 구상체를 분리하여 밀리리터 너비의 보어 팁 하나를 사용하여 부드럽게 피펫팅하고, 이를 조직 배양 접시로 옮깁니다.구상체 형태를 충분히 선택하려면 현미경으로 구상체의 품질을 확인하십시오. 좋은 품질의 구상체는 균일 한 크기, 컴팩트 함 및 원형도를 가지고 있습니다. 평형 생물 반응기에 다섯 밀리리터의 신선한 성장 배지를 채우고 구상체를 그 안으로 옮깁니다.그런 다음 생물반응기를 신선한 성장 배지로 완전히 채우고 생물반응기를 클리노스타트 인큐베이터에 넣고 10 내지 11 RPM으로 한다. 이틀에서 사흘에 한 번씩 10밀리리터의 오래된 미디어를 신선한 미디어로 대체하여 성장 미디어를 교환합니다. 이 구상체의 크기와 수가 증가함에 따라 인큐베이터의 회전 속도가 증가합니다.스페로이드 펠렛을 얻은 후, 펠릿과 피펫에 다섯 부피의 차가운 0.2 몰 황산을 위아래로 첨가하여 펠렛을 파괴하고 히스톤을 방출하십시오. 원심분리 후 상층액이 얻어지면 차가운 농축 트리클로로 아세트산을 첨가하여 최종 농도가 25 ~ 30 % 부피 %가되도록하십시오. 그리고 원고에 기재된 바와 같이 튜브를 몇 번 반전시키고 원심분리하여 혼합한다.상층액을 버린 후, 유리 목초지 피펫을 사용하여, 펠릿과 튜브의 벽을 약 500 마이크로리터의 차가운 아세톤과 0.1% 염산으로 세척한 다음, 섭씨 4도에서 5분 동안 3, 400 x g에서 원심분리한다. 그런 다음 튜브를 뒤집어 상층액을 버립니다. 유리 목초지 피펫을 사용하여 500 마이크로 리터의 100 % 차가운 아세톤을 첨가하여 이전에 입증 된 바와 같이 펠렛과 원심 분리기를 세척하십시오.상층액을 버린 후, 조심스럽게 피펫팅하여 아세톤을 완전히 제거하고, 샘플을 열린 뚜껑으로 약 20분 동안 건조시킨다. 펠렛을 pH 8의 100 밀리몰 암모늄 중탄산염에서 15 내지 20%의 아세토니트릴의 20 마이크로리터에 재현탁시킨다. 볼텍싱 후, 현탁액을 1000 x g에서 30초 동안 스핀다운시킨다.여덟 개 이상의 샘플의 경우, 각각의 재현탁된 샘플을 96-웰 플레이트로 옮긴다. 그런 다음 후드에 두 마이크로 리터의 프로피온성 무수물을 넣고 다섯 번 피펫팅하여 혼합하십시오. 수산화 암모늄 10 마이크로 리터를 신속하게 넣고 다섯 번 피펫팅하여 혼합하십시오.HLB 수지를 마그네틱 교반 플레이트에 섞는다. 그런 다음 70 마이크로리터의 HLB 현탁액을 96-웰 수집 플레이트 상의 96-웰 필터 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 유동을 폐기한 후, 수지를 0.1%트리플루오로아세트산 100 마이크로리터로 세척한다.각 샘플을 0.1% 트리플루오로아세트산 100마이크로리터에 재현탁시킨 후 각 샘플을 각 웰에 넣고 진공을 사용하여 튀는 것을 방지합니다. 유동을 폐기한 후, 샘플을 100 마이크로리터의 0.1%트리플루오로아세트산으로 세척하고, 필터 플레이트를 새로운 수집 플레이트 상에 놓는다. 다음으로, 0.1 % 트리플루오로 아세트산에 60 마이크로 리터의 60 % 아세토 니트릴을 각 웰에 넣고 진공을 사용하여 튀는 것을 방지하십시오.통과된 흐름을 수집하고 속도 진공에서 건조시킨다. 건조 된 수집 플레이트를 HPLC에로드하고 원고에 설명 된대로 LC / MS / MS 방법을 실행하십시오. 이 연구에서, 일반적인 히스톤 번역 후 변형의 상대적 풍부도는 3차원 구상체로서 성장한 C3A 간세포에서 관찰되었다.번역 후 변형은 또한 히스톤 단백질로부터 생성된 펩티드의 단일 잔기에서 관찰될 수 있었다. 구상체를 나트륨 부티레이트로 처리하면 히스톤 아세틸화의 상대적 풍부도가 증가한 반면, 숙시네이트 나트륨을 사용하면 히스톤 잔기가 숙시닐화되었습니다. 이 방법은 또한 나트륨 부티레이트 처리 후 히스톤 아세틸화의 분포 패턴과 숙시네이트 나트륨으로 처리 한 후 히스톤 숙시닐화의 분포 패턴을 입증했다.결과는 또한 다른 히스톤 변형의 공통 패턴을 보여주었습니다. 소듐 부티레이트 처리는 히스톤 단백질 H3로부터 생성된 펩티드 상의 리신 잔기 14의 아세틸화를 상당히 향상시켰는데, 이는 그의 아홉 번째 라이신 잔기가 두 개의 메틸기를 가졌으나 하나 또는 세 개의 메틸기가 없는 경우에만 그러했다. H3 유래 펩티드에서의 개별 변형 및 번역 후 변형의 다양한 조합의 상대적 풍부도가 또한 계산되었다.소듐 부티레이트 처리 후 번역 후 변형의 조합 패턴은 히스톤 단백질 H4로부터 생성된 펩티드에서도 관찰되었다. 여기에서도, 나트륨 부티레이트 처리는 아세틸화의 현저한 증가를 가져왔다. 시료 유출을 피하기 위해 구상체를 가능한 한 적게 벤치에 보관하고 탈염 단계에서 구상체를 유지하는 데 중요한주의를 기울여야합니다. 이 워크 플로우는 평평한 세포 배양을 빠르게 복제하는 것보다 더 생리적 인 모델을 사용하여 고체 조직에서 크로마틴을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다.

간 조직의 3D 세포 배양 모델에서 히스톤 번역 후 변형의 글로벌 수준 정량화

Abstract