Vi är mycket tacksamma för hjälpen från Cattle Fever tick Laboratory i Edinburg, Texas. Vi vill tacka Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado och Homer Vasquez. Vi vill också uppmärksamma hjälpen från Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario och Stephanie Guzman Valencia under hela projektet. Vi vill tacka Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group för deras hjälp och råd under skrivandet av detta manuskript. Följande reagenser tillhandahölls av Centers for Disease Control and Prevention för distribution av BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Kvinnliga I. scapularis-fästingar mottogs också från Tick Rearing Facility vid Oklahoma State University. Detta projekt finansierades av Texas A&M University T3: triader för transformationsbidrag och samarbetsavtalet #58-3094-1-003 av USDA-ARS till AOC.

Alla djurförsök utfördes enligt djuranvändningsprotokoll (AUP # 2020-0026) godkänt av institutionens djurvårds- och användningskommitté (AICUC) vid Texas A &M University. Fästingarterna, Ixodes scapularis och Rhipicephalus (Boophilus) microplus, och Nya Zeelands vita hankaniner, 42-72 dagar gamla, användes för den aktuella studien. I. scapularis mottogs från Center for Disease Control (CDC) och Oklahoma State University, certifierad som patogenfri. R. microplus föddes upp...

Det nuvarande protokollet ger en detaljerad metod för att extrahera miRNA från spottkörtlar och elbilar. Det finns dock viktiga överväganden, som alla beskrivs i anteckningarna för varje avsnitt i detta protokoll. Kapseln och nätnätet måste säkras under fästingmatning för att förhindra att fästingar släpper ut. Kapselberedningen och placeringen beskrivs i Koga et al.40. Flera replikat av fästingdissektionerna måste göras om ett olämpligt prov kasseras. Dessutom kan flera utmanin...

Fästingar är ektoparasiter som vektoriserar många patogener till vilda djur, boskap, människor och deras husdjur 1,2. Fästingmatning resulterar i betydande ekonomisk förlust genom att orsaka skador på hud, minska vikt och mjölkproduktion på grund av svår anemi och överföring av potentiellt dödliga sjukdomsframkallande patogener 1,3,4,5. Nuvarande kontrollmetoder för hantering av fästingpopulationer är inriktade på användningen av akaricider. Ändå har den kontinuerliga uppkomsten av akaricidresistens hos fästingar som parasiterar boskap 5,6, den ökade förekomsten av fästingbett7 och patogenöverföring inom bostadsområden 8,9 lett till ett behov av unika fästingkontrollalternativ.
Fästingens spottkörtlar är viktiga organ som säkerställer en fästings biologiska framgång. De bildas av olika acinustyper (I, II, III och IV) med olika fysiologiska funktioner. Spottkörtlarna är ansvariga för osmoregulation, både av och på värden, genom att återföra vattenöverskott och järninnehåll till värden via salivation 2,10. Typ I acini är också involverade i upptaget av vatten från atmosfären genom utsöndring av hygroskopisk saliv10,11. Saliveffektorproteiner, såsom cement och cystatiner, produceras i sekretoriska celler i typ II och III acini 10,12. Typ I acini påverkar inte fästingmatning, vilket indikerar att blodmjölsintaget inte utlöser morfologiska och fysiologiska förändringar i dessa acini typ13,14. Å andra sidan aktiveras Acini typ II och III under utfodring och presenterar mycket liten aktivitet före fastsättning. Således är utfodring nödvändig för att utlösa utvidgningen av sekretoriska celler inom typ II acini och produktionen av bioaktiva föreningar. Typ III acini reduceras i storlek under utfodring på grund av utsöndringen i sekretoriska granuler12.
Spottkörtlarna är också platsen för patogeninfektion i fästingen och överföringsvägen. Under utfodring utsöndrar fästingar flera föreningar med farmaceutiska effekter som behövs för framgångsrik slutförande av blodmjölet 10,15,16. Dessa föreningar har antiinflammatoriska, immunsuppressiva och vasodilaterande egenskaper 10,15,17. Nya studier har visat att extracellulära vesiklar (EV) som härrör från fästingspottkörtlar har flera av dessa föreningar, vilket inducerar antiinflammatoriska och immunmodulerande effekter 18,19,20. "Extracellulära vesiklar" är ett paraplybegrepp som används för att beskriva vesiklar klassificerade som exosomer och mikrovesiklar baserat på deras storlek och biogenes. Sammantaget är elbilar lipidblbs med dubbelskiktsmembran som är ~ 40 nm-1 μm i storlek21; i allmänhet beskrivs exosomer som 40-150 nm stora, medan mikrovesiklar är mellan 150 nm-1 μm i storlek 21,22,23. Storleken är dock inte en indikation på elbilens biogenesväg22.
Biogenesen av exosomer börjar med sekventiell invagination av plasmamembranet. Denna invagination leder till bildandet av multivesikulära kroppar och resulterar slutligen i deformation av det vesikulära membranet genom verkan av ESCRT-komplex eller sfingomyelinaser (sMases)24,25. Exosomerna kan antingen lyseras i lysosomerna för att upprätthålla cellulär homeostas eller avslutas via vesikulär fusion till plasmamembranet för att leverera cellulära beståndsdelar till mottagarcellerna21,24. Å andra sidan bildas mikrovesiklar genom verkan av flopasses och flipasses, vilket förändrar konformationen av lipider i plasmamembranet26. Elbilar är viktiga för cell-till-cell-kommunikation och fungerar som ett transportsystem för intracellulär last, såsom lipider, proteiner, nukleinsyror och mikroRNA (miRNA)21,27,28. När de väl har transporterats levererar dessa vesiklar sin last till cytoplasman hos mottagarcellerna och genererar fenotypiska förändringar i mottagarcellen22,29. På grund av vikten av extracellulära vesiklar vid fästingmatning och manipulation av värdens immun- och sårläkningssvar18,20, presenterar lasten inom extracellulära vesiklar potentiella mål för utveckling av anti-tick-terapier och en unik mekanism för att störa fästingmatning. Detta inkluderar miRNA inom fästingspottkörtlar och spottkörtel-härledda extracellulära vesiklar.
miRNA är korta icke-kodande sekvenser, ~ 18-22 nukleotid (nt) i längd, som kan post-transkriptionellt reglera, bryta ner eller tysta mRNA-sekvenser30,31. Under transkription klyvs pri-miRNA av Dicer (RNA-polymeras III) för att bilda en distinkt hårnålsliknande struktur och blir ett pre-miRNA. Pre-miRNA skärs återigen av Drosha (RNA-polymeras III) för att bilda en mogen miRNA-duplex. Den mogna sekvensen integreras i det RNA-inducerade ljuddämpningskomplexet (RISC) som kompletterar mRNA-sekvensen, vilket orsakar translationsförtryck eller mRNA-nedbrytning 28,30,32. Under värdmatning kan miRNA i fästingsaliv modulera värdgenuttryck för att undertrycka immunsvar och förbättra patogenöverföringen 33,34,35,36,37. Även om det finns omfattande studier om elbilar och miRNA, är deras roller under utfodring vid fästing-värdgränssnittet fortfarande dåligt förstådda. Att optimera protokoll som enkelt kan resultera i isolering och rening av högkvalitativa miRNA är avgörande för att främja vår kunskap om dessa ämnen.
Flera alternativ kan användas för att isolera elbilar, såsom ultracentrifugering, exosomutfällning, polymerutfällning, immunoaffinitetskromatografi och storleksbaserade uteslutningstekniker38. Dessa tekniker kan emellertid inte skilja mellan exosomer eller mikrovesiklar. Således, som tidigare nämnts, används EV som ett paraplybegrepp när man isolerar elbilar från olika prover. Vesiklarna isolerade i experimenten som beskrivs här representerar en blandning av vesiklar härledda från olika biogenesvägar. Ytterligare rening av en specifik population av extracellulära vesiklar kan uppnås genom immunoprecipitation med användning av pärlor belagda med antikroppar mot markörer (dvs exosomala markörer, tumörmarkörer) som är unika för vesikelpopulationen av intresse39,40. miRNA kan också extraheras via olika kommersiellt tillgängliga isoleringssatser 7,41,42.
Målet med detta projekt var att utveckla ett protokoll som kombinerar vanligt förekommande metoder för att isolera elbilar och extrahera miRNA från både elbilar och spottkörtlar. Eftersom utsöndringen av bioaktiva föreningar aktiveras genom att mata12, bör fästingar tillåtas att mata för att identifiera miRNA som kan vara viktiga för att manipulera värdens immun- och sårläkningssvar. Det nuvarande protokollet kräver ett litet antal fästingar (20 fästingar) för att isolera elbilar och deras respektive miRNA, jämfört med andra tidigare beskrivna studier som krävde 2000 fästingar43. Vidare undviker det kontaminering av salivutsöndringar med pilokarpin44, vilket kan påverka experiment som studerar effekten av elbilar och deras miRNA på värdceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m nylon syringe filter</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>283129028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 inch black adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00FQ937NM</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL needeless syringe</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; and 5&#39; Adapters</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.1523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Macron</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyverse Discovery Enviornment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sideded carpet tape</td>
			<td>amazon</td>
			<td>&#8206;286373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FBS-02-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>5-S-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foamies, 2 mm</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004M5QGBQ</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals manfactured</td>
			<td>193.33165.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ixodes scaplaris</td>
			<td>CDC, Oklahoma State University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15C300 medium</td>
			<td>In-lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoprotein-cholesterol concentrate</td>
			<td>MPI</td>
			<td>02191476-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRDeep2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade ethanol</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well 24 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopaticle Tracking Analyzer machine</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep with 300K Omega filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD3003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ICN19453780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Ependorff</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate centrifuge bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q32880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Universal Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhipicephalus microplus</td>
			<td>Cattle Fever Tick Research Labratoty</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fischer Bioreagents</td>
			<td>215544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>833280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>11111729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Minelute spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT Forward Primer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024906</td>
			<td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td>Qiagen miRNeasy kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Gauze sponges</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBK0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>thermofischer Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>7.42836E+11</td>
			<td>Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M VetBond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Antibiotics</td>
			<td>dechra</td>
			<td>17033-122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 260300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of micrornas from tick ex vivo salivary gland cultures and extracellular vesicles

Fästingar är viktiga ektoparasiter som kan vektorisera flera patogener. Spottkörtlarna hos fästingar är viktiga för utfodring eftersom deras saliv innehåller många effektorer med farmaceutiska egenskaper som kan minska värdens immunsvar och förbättra patogenöverföringen. En grupp av sådana effektorer är mikroRNA (miRNA). miRNA är korta icke-kodande sekvenser som reglerar värdgenuttryck vid tick-host-gränssnittet och inom fästets organ. Dessa små RNA transporteras i fästingsaliv via extracellulära vesiklar (EV), som tjänar inter- och intracellulär kommunikation. Vesiklar som innehåller miRNA har identifierats i saliv av fästingar. Men lite är känt om miRNA: s roller och profiler i fästingspyttblåsor och körtlar. Dessutom kräver studien av vesiklar och miRNA i fästingsaliv tråkiga procedurer för att samla fästingsaliv. Detta protokoll syftar till att utveckla och validera en metod för att isolera miRNA från renade extracellulära vesiklar som produceras av ex vivo-organkulturer . De material och metoder som behövs för att extrahera miRNA från extracellulära vesiklar och tick spottkörtlar beskrivs här.

Det nuvarande protokollet ger en detaljerad metod för att extrahera miRNA från spottkörtlar och elbilar. Enligt resultaten är detta protokoll effektivt för isolering av miRNA från vuxna av två olika fästingarter, I. scapularis och R. microplus, och kan potentiellt också användas i andra fästingarter. Elbilens koncentration (partiklar/ml) mättes via NTA. För R. microplus innehöll varje kön och livsstadium tre biologiska replikat uppmätta i tre tekniska replikat. Proverna...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Det nuvarande protokollet beskriver isoleringen av mikroRNA från fästingspottkörtlar och renade extracellulära vesiklar. Detta är ett universellt förfarande som kombinerar vanliga reagenser och förnödenheter. Metoden tillåter också användning av ett litet antal fästingar, vilket resulterar i mikroRNA av hög kvalitet som lätt kan sekvenseras.

Isolering av mikroRNA från Tick Ex Vivo spottkörtelkulturer och extracellulära vesiklar

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Detta protokoll tillåter oss att använda ett minskat antal fästingar vilket minskar kostnaden för koloniunderhåll och minskar antalet ryggradsdjur som behövs för fästingmatning. Detta protokoll kräver cirka 20 fästingar. Den största fördelen förutom att använda en liten provstorlek är dock att detta protokoll kan tillämpas på flera fästingarter och olika livsstadier.Bortsett från fästingdissektioner eller appliceringen mot värd-parasitinteraktioner, effekten av patogeninfektion på mikroRNA-utsöndring och effekten av fysiologiska förändringar på mikroRNA som utsöndras av fästingar. Börja med att förbereda vesikelfria medier genom att tillsätta fosterbovint serum, tryptosfosfatbuljong, 10% lipoproteinkolesterolkoncentrat, 5% natriumbikarbonat, HEPES och L15C300-medium i en 26,3 ml polykarbonatcentrifugflaska och justera volymen efter behov. Ultracentrifugera nu mediet vid 100 000 gånger G vid fyra grader Celsius i 18 timmar.Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten och överför supernatanten till ett nytt centrifugrör. Ultracentrifugera röret igen. Ta supernatanten och för den genom ett 0,22 mikrometerfilter för att avlägsna föroreningar.Pipettera supernatanten i ett 50 ml centrifugrör och förvara det vid minus 20 grader Celsius tills det behövs eller upp till tre år. Tillsätt en lämplig mängd antibiotika till 500 mikroliter av det vesikelfria mediet i varje brunn i en odlingsplatta med 24 brunnar. Lägg nu till PBS med rifampicin i brunnarna som inte innehåller vesikelfritt medium för att förhindra bakterietillväxt.Placera fästingarna på en glasskiva med dubbelsidig matttejp under ett dissekerande mikroskop. Innan dissektion, tillsätt PBS som innehåller rifampicin till fästet och använd fyra millimeter Vannas sax, gör ett snitt på ungefär en millimeter på sidan av varje kvinna. Ta nu bort fästingens dorsala sida och spottkörtlar och lägg sedan 20 till 40 fästingspottkörtlar i 500 mikroliter vesikelfritt medium tillsatt till en enda brunn i en 24-brunns vävnadsodlingsbehandlad platta.Inkubera spottkörtelproverna vid 32 grader Celsius i 24 timmar för att möjliggöra utsöndring av de extracellulära vesiklarna. Vid slutet av inkubationen, pipettera allt medium som innehåller spytkörtlarna i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 300 gånger G vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.Återsuspendera pelleten som innehåller spottkörtlarna i RNA senare och förvara vid minus 80 grader Celsius tills den används eller på obestämd tid. Ta nu bort det cellulära skräpet genom att centrifugera supernatanten vid 2 000 gånger G vid fyra grader Celsius i 10 minuter och pipettera supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera sedan vid 10 000 gånger G i 30 minuter vid fyra grader Celsius för att avlägsna apoptotiska kroppar och större extracellulära vesiklar och överföra supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.Montera sedan ett nylonsprutfilter på en mikrometer på en 10 ml spruta och förvara det på ett ultracentrifugrör. Tillsätt sedan provet och fyll sprutan med 10 ml PBS. För supernatanten genom filtret in i röret.Efter filtrering och balansering av rören, placera dem i en 70 Ti-rotor och ultracentrifugera rören vid 100 000 gånger G i 18 timmar vid fyra grader Celsius. De koncentrerade extracellulära vesiklarna bildar en pellet efter ultracentrifugering. Ta bort supernatanten utan att störa pelleten och återsuspendera pelleten i PBS.Pipettera 500 mikroliter av den extracellulära vesikeln i ett 300 K centrifugalfilter och centrifugera vid 8 000 gånger G i 10 minuter vid omgivningstemperatur och upprepa denna procedur tills alla extracellulära vesiklar filtreras. Slutligen tillsätt 400 mikroliter steriliserad PBS till kolonnen och blanda noggrant för att avlägsna extracellulära vesiklar fästa vid membranet. Lägg sedan provet i ett 1,5 ml DNAase RNAse-fritt rör.Koncentrationen och storleken på extracellulära vesiklar varierade beroende på kön och livsstadiet hos fästingarna mellan de biologiska replikaten för kvinnor, män och nymfer. För alla kombinerade biologiska replikat observerades liknande resultat. Analys av små RNA isolerade från spottkörteln visade band som motsvarade ribosomalt RNA och mikroRNA.De ribosomala RNA var emellertid frånvarande i vesiklarna isolerade från spottkörtlarna, och mikroRNA-prover renade från extracellulära vesiklar visade mer nedbrytning. Efter anrikning visade mikroRNA-proverna renade från elbilar minimal nedbrytning och tillräcklig mikroRNA-koncentration för cDNA-bibliotekssyntes. Den förväntade bandstorleken på cirka 150 baspar efter att cDNA-biblioteksberedning erhölls betyder små RNA-cDNA-bibliotek.Under vesikelfri beredning, se till att följa stegen för att förhindra extern vesikelkontaminering. Under väl plattberedning, se till att tillsätta antibiotika för att förhindra bakteriell kontaminering från fästmikrobiomet. De mikroRNA som extraheras med hjälp av detta protokoll kan användas för profilering och funktionella experiment för att validera mikroRNA-roller som att förutsäga mikroRNA-vägmål, hämning och mimikexperiment.

Isolering av mikroRNA från Tick Ex Vivo spottkörtelkulturer och extracellulära vesiklar

Abstract