Нейтронная спектроскопия высокого разрешения для исследования пикосекундно-наносекундной динамики белков и гидратационной воды

Summary

Спектроскопия обратного рассеяния нейтронов обеспечивает неразрушающий и свободный от меток доступ к ps-ns динамике белков и их гидратационной воде. Рабочий процесс представлен двумя исследованиями амилоидных белков: динамики лизоцима во время агрегации с временным разрешением и динамики гидратационной воды тау при образовании волокон.

Abstract

Рассеяние нейтронов дает возможность исследовать динамику в образцах для широкого диапазона энергий неразрушающим способом и без маркировки, кроме дейтерия. В частности, спектроскопия обратного рассеяния нейтронов регистрирует сигналы рассеяния при нескольких углах рассеяния одновременно и хорошо подходит для изучения динамики биологических систем на шкале времени ps-ns. Используя_D2O- и, возможно, дейтерированные буферные компоненты, метод позволяет контролировать как диффузию центра масс, так и движения основной цепи и боковой цепи (внутреннюю динамику) белков в жидком состоянии.

Кроме того, динамика гидратационной воды может быть изучена с использованием порошков пердейтерированных белков, гидратированных с H₂O. В этой статье представлен рабочий процесс, используемый на приборе IN16B в Институте Лауэ-Ланжевена (ILL) для исследования динамики белковой и гидратационной воды. Объясняется приготовление образцов раствора и образцов гидратированного протеинового порошка с использованием парообмена. Описана процедура анализа данных как белковой, так и гидратационной динамики воды для различных типов наборов данных (квазиупругие спектры или сканирование с фиксированным окном), которые могут быть получены на спектрометре обратного рассеяния нейтронов.

Метод проиллюстрирован двумя исследованиями с участием амилоидных белков. Показано, что агрегация лизоцима в сферические агрегаты размером с мкм, обозначенные частицами, происходит в одностадийном процессе в пространственно-временном диапазоне, исследованном на IN16B, в то время как внутренняя динамика остается неизменной. Далее изучали динамику гидратации воды тау на гидратированных порошках пердейтерированного белка. Показано, что поступательные движения воды активируются при образовании амилоидных волокон. Наконец, обсуждаются критические шаги в протоколе относительно того, как рассеяние нейтронов позиционируется по отношению к изучению динамики по отношению к другим экспериментальным биофизическим методам.

Introduction

Нейтрон представляет собой массивную частицу без заряда, которая на протяжении многих лет успешно использовалась для зондирования образцов в различных областях от фундаментальной физики до биологии¹. Для биологических применений широко используются малоугловое рассеяние нейтронов, неупругое рассеяние нейтронов, а также нейтронная кристаллография и рефлектометрия ^2,3,4. Неупругое рассеяние нейтронов обеспечивает усредненное по ансамблю измерение динамики, не требующее специфической маркировки как таковой, и качество сигнала, которое не зависит ....

Protocol

1. Подготовьте дейтерированный буфер для белков в жидком состоянии

1. Растворите все компоненты буфера в чистом виде D₂O.
2. Если pH-электрод был откалиброван в H₂O, отрегулируйте pD по формуле pD = pH + 0,4 с помощью NaOD или DCl³⁴.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование D 2 O вместо H₂O может повлиять на растворимость белка, и, возможно, потребуется адаптировать буферные условия (например, путем небольшого изменения концентрации соли).

2. Приготовьте H₂O-гидратированные порошки пердейтерированного белка.

1. Под....

Discussion

Нейтронная спектроскопия является единственным методом, позволяющим зондировать усредненную по ансамблю ps-ns динамику образцов белка независимо от размера белка или сложности раствора при использовании дейтерации⁶. В частности, исследуя самодиффузию белковых сборок в ра.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum sample holder			Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D	Sigma-Aldrich	543047
Deuterium oxide (D, 99.9%)	Eurisotop	DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease	Sigma-Aldrich	Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur	Sigma-Aldrich	1.5901
Glass dessicator	VWR	75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm	VWR	89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%	Alfa Aesar	00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg	Sigma-Aldrich	62970
nPDyn		v3.x	see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration	Dutscher	92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%	Sigma-Aldrich	214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL	Starlab	S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL	Starlab	S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL	Starlab	S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL	Starlab	S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL	Starlab	S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL	Starlab	S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D	Sigma-Aldrich	372072