Microdissection laser pour les applications mono-tissulaires indépendantes des espèces

Les méthodologies unicellulaires ont révolutionné l’analyse des transcriptomes de types cellulaires spécifiques. Cependant, ils nécessitent souvent des « boîtes à outils » génétiques spécifiques à l’espèce, telles que des promoteurs conduisant à l’expression tissulaire spécifique des protéines fluorescentes. De plus, les protocoles qui perturbent les tissus pour isoler les cellules individuelles éliminent les cellules de leur environnement natif (par exemple, la signalisation des voisins) et peuvent entraîner des réponses au stress ou d’autres différences par rapport aux états d’expression des gènes natifs. Dans le présent protocole, la microdissection laser (LMD) est optimisée pour isoler les extrémités individuelles de la queue des nématodes pour l’étude de l’expression génique au cours de la morphogenèse de la pointe de la queue mâle.

LMD permet l’isolement d’une partie de l’animal sans avoir besoin de perturbation cellulaire ou de boîtes à outils spécifiques à l’espèce et est donc applicable à toutes les espèces. Par la suite, des protocoles de préparation de bibliothèque d’ARN-seq unicellulaires tels que CEL-Seq2 peuvent être appliqués à des tissus uniques isolés de LMD et analysés à l’aide de pipelines standard, étant donné qu’un génome ou un transcriptome bien annoté est disponible pour l’espèce. Ces données peuvent être utilisées pour établir dans quelle mesure les transcriptomes sont conservés ou différents qui sous-tendent le développement de ce tissu chez différentes espèces.

Les limites comprennent la capacité de découper le tissu d’intérêt et la taille de l’échantillon. Une analyse de puissance montre qu’aussi peu que 70 embouts de queue par condition sont nécessaires pour une puissance de 80%. Une synchronisation étroite du développement est nécessaire pour obtenir ce nombre d’animaux au même stade de développement. Ainsi, une méthode de synchronisation des animaux à des intervalles de 1 heure est également décrite.