מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה קלה להדמיה תוך-חיונית של בלוטת החלב של עכבר מניק, באמצעות סריקת לייזר, מיקרוסקופ קונפוקלי ומולטיפוטון.

Abstract

בלוטת החלב מהווה מודל מצוין לחקר תפקודי אפיתל, כולל עיצוב מחדש של רקמות, קוטביות התא ומנגנוני הפרשה. במהלך ההריון, הבלוטה מתרחבת מעץ צינורי פרימיטיבי המשובץ בכרית שומן לרשת מכתשית מסועפת מאוד המוכנה להיווצרות והפרשת קולוסטרום וחלב. לאחר הלידה, הבלוטה מספקת את כל החומרים המזינים הדרושים להישרדות היילוד, כולל טיפות שומנים מצופות קרום (LDs), חלבונים, פחמימות, יונים ומים. רכיבי חלב שונים, כולל לקטוז, מיצלות קזאין וחלבוני חלב רזה, מסונתזים בתוך תאי הנאדיות ומופרשים משלפוחיות על ידי אקסוציטוזה על פני השטח האפיקאליים. LDs מועברים מאתרי סינתזה ברשתית האנדופלסמית המחוספסת אל קודקוד התא, מצופים בקרומי התא, ומופרשים על ידי מנגנון אפוקריני ייחודי. מרכיבים מוכנים אחרים, כולל נוגדנים והורמונים, מועברים מהצד הסרוסלי של האפיתל לחלב על ידי טרנסציטוזה. תהליכים אלה מקובלים מיקרוסקופיה intravital כי בלוטת החלב היא בלוטת העור, ולכן, נגיש ישירות מניפולציה ניסיונית. במאמר זה מתואר הליך קל לחקר הקינטיקה של הפרשת LD באתרה, בזמן אמת, בעכברים מורדמים חיים. Boron-dipyrromethene (BODIPY)_665/676 או monodansylpentane משמשים לסימון החלק השומני הניטרלי של עכברים טרנסגניים, אשר מבטאים EGFP מסיס (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר) בציטופלסמה, או פפטיד ממוקד קרום מאוחה ל- EGFP או tdTomato. חלבוני האיחוי המתויגים בקרום משמשים כסמנים של משטחי התא, וצבעי השומנים פותרים LDs ≥ 0.7 מיקרומטר. תמונות בהילוך מהיר ניתנות להקלטה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי לסריקת לייזר עד לעומק של 15-25 מיקרומטר או על ידי מיקרוסקופ מולטיפוטון לצורך הדמיה עמוקה יותר ברקמה. בלוטת החלב עשויה להיות שטופה בחומרים פרמקולוגיים או צבעים פלואורסצנטיים לאורך כל הניתוח, מה שמספק פלטפורמה למניפולציות ניסיוניות חריפות לפי הצורך.

Introduction

מיקרוסקופ תוך חיוני של בלוטת החלב של העכבר מושך תשומת לב מוגברת כשיטה רבת עוצמה לניתוח מגוון שלם של תופעות ביולוגיות, כולל המקור וההתמיינות של תאי גזע ^1,2, התקדמות גידולים גרורתיים ^3,4,5, ותפקידם של מקרופאגים דוקטליים לאורך התפתחות החלב ואינבולוציה⁶. באמצעות הפיתוח של מיקרוסקופ תת-תאי תוך-תאי (ISMic)⁷, החקירות הורחבו לתנועת קרום ומנגנוני הפרשה במהלך הנקה ^8,9, והתכווצות בתיווך אוק....

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות בהתאם למדריך של מועצת המחקר הלאומית של ארה"ב לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, מדיניות שירות בריאות הציבור של ארה"ב בנושא טיפול אנושי וש?.......

Discussion

ההחלטה אם להשתמש במיקרוסקופ חד-פוטוני או רב-פוטוני תלויה בשאלות הנשאלות, באופי ובמיקום הרקמה שיש לצלם וברזולוציה הנדרשת. מיקרוסקופים מרובי פוטונים מבוססים על יצירת שני פוטונים או יותר בעלי אנרגיה נמוכה באינפרא אדום הקרוב, אשר יכולים לחדור רקמות לעומק רב יותר עם פחות פו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
488 laser	Melles-Griot	-	CW  laser 50 mW
60x PLAPON oil immersion objective (NA 1.42)	Olympus	1-U2B933	Lens Confocal microscope
633 laser	Melles-Griot	-	CW He-Ne laser 12 mW
63x objective (NA 1.40, HC PL APO CS2)	Leica	11506350	Lens Two-photon microscope
BA 410-460 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 495-540 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 505-605 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 655-755 nm	Chroma	-	Band-pass filter
Boron-dipyrromethane (BODIPY) 665/676	Thermo Fisher Scientific	B3932	Lipid peroxiation sensor
Carbomer-940	Snowdrift Farm	739601480651	Gel
Catheter	Terumo	SV27EL	Winged infusion sets
Cauterizer	Braintree Scientific, Inc	GEM 5917	Cautery system
CMV-Cre mouse	Jackson lab	006054	Mouse line
Coverslip	Bioptechs	-	30mm diameter coverlip for inverted microscope
Curity 4x4 inch all purpose sponge gauze	Covidien	9024	Sponge
EGFPcyto mouse	Jackson lab	003291	Mouse line
Fiji/ImageJ software	Open source	-	Free software tool
Fine forceps	Braintree Scientific, Inc	FC003 8	Tissue forceps
Fluoview 1000 microscope	Olympus	FV1000	Confocal microscope
FluoView software	Olympus	-	Confocal microscope and Two-photon microscope
Hand-held electric razor	Braintree Scientific, Inc	CLP-8786-451A	Cordless clipper
Heat pad	Braintree Scientific, Inc	DPIP	Heat pad for animals
HyD detectors	Leica	-	Leica 4Tune spectral detector
Imaris software	Bitplane / Oxford instruments	-	Commercial software tool
Ingisht X3 tunable laser	Spectra Physics	Insight X3	Tunable Pulse-Laser
Isoflurane	VetOne	13985-046-40	Anesthetic
Ketamine	VetOne	13985-702-10	Anesthetic
LAS X Software	Leica	-	Two-photon microscope software tool
Mai-Tai tunable laser	Spectra Physics	Mai-Tai	Laser
MetaMorph	Molecular Devices	-	Commercial software tool
Monodansylpentane AUTODOT	Abcepta	Sm1000a	Lipid droplet dye
MPE-RS microscope	Olympus	IX70	Two-photon microscope
mT/mG mouse	Jackson lab	007676	Mouse line
Objective heater	Bioptechs	150819	Objective heater for both confocal and two-photon microscopes
Oxygen-saturated respiration chamber	Patterson Scientific	78933385, SAS3 and EVAC4	Gas Anesthesia and evacuation system
Parafilm	Heathrow Scientific	HS234526B	Semi-transparent, flexible, thermoplastic film
PMT detector	Olympus	-	Descanned   detectors
PMT detector	LSM-Technology	Custom built	Non-Descanned Detectors
Pump	Harvard Apparatus	703602, 704402	Nanomite injector and controller
Saline	Quality Biological	114-055-721EA	Normal saline
Sharp blunt-ended scissors	Braintree Scientific, Inc	SCT-S 508	Surgical scissors
Syringe	Covidien	22-257-150	1mL tuberculin syringe
TCS SP8 Dive Spectral microscope	Leica	SP8	Two-photon microscope
Tweezers	Braintree Scientific, Inc	FC032	Tissue forceps
Xylazine	VetOne	13985-704-10	Anesthetic