Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária

Summary

O presente protocolo descreve uma técnica fácil para a imagem intravital da glândula mamária de camundongos lactantes por microscopia confocal e multifotônica de varredura a laser.

Abstract

A glândula mamária constitui um modelo por excelência para investigar funções epiteliais, incluindo remodelação tecidual, polaridade celular e mecanismos secretores. Durante a gravidez, a glândula se expande de uma árvore ductal primitiva embutida em uma almofada de gordura para uma rede alveolar altamente ramificada, preparada para a formação e secreção de colostro e leite. No pós-parto, a glândula fornece todos os nutrientes necessários para a sobrevivência neonatal, incluindo gotículas lipídicas revestidas por membrana (LDs), proteínas, carboidratos, íons e água. Vários componentes do leite, incluindo lactose, micelas de caseína e proteínas do leite desnatado, são sintetizados dentro das células alveolares e secretados das vesículas por exocitose na superfície apical. Os LDs são transportados de locais de síntese no retículo endoplasmático rugoso para o ápice celular, revestidos com membranas celulares e secretados por um mecanismo apócrino único. Outros constituintes pré-formados, incluindo anticorpos e hormônios, são transportados do lado seroso do epitélio para o leite por transcitose. Esses processos são passíveis de microscopia intravital porque a glândula mamária é uma glândula cutânea e, portanto, diretamente acessível à manipulação experimental. Neste artigo, um procedimento fácil é descrito para investigar a cinética da secreção de LD in situ, em tempo real, em camundongos vivos anestesiados. Boro-dipirrometeno (BODIPY) _665/676 ou monodansilpentano são usados para rotular a fração lipídica neutra de camundongos transgênicos, que expressam EGFP solúvel (proteína fluorescente verde aprimorada) no citoplasma ou um peptídeo direcionado à membrana fundido a EGFP ou tdTomato. As proteínas de fusão marcadas com membrana servem como marcadores de superfícies celulares, e os corantes lipídicos resolvem LDs ≥ 0,7 μm. As imagens de lapso de tempo podem ser gravadas por microscopia confocal de varredura a laser padrão até uma profundidade de 15-25 μm ou por microscopia multifotônica para imagens mais profundas no tecido. A glândula mamária pode ser banhada com agentes farmacológicos ou corantes fluorescentes durante toda a cirurgia, fornecendo uma plataforma para manipulações experimentais agudas, conforme necessário.

Introduction

A microscopia intravital da glândula mamária de camundongo está atraindo cada vez mais atenção como um método poderoso para analisar toda uma gama de fenômenos biológicos, incluindo a origem e diferenciação de células-tronco ^1,2, a progressão de tumores metastáticos ^3,4,5 e o papel dos macrófagos ductais ao longo do desenvolvimento e involução mamária⁶. Através do desenvolvimento da Microscopia Subcelular Intravital (ISMic)⁷, as investig....

Protocol

Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde em conformidade com o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa dos EUA para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, a Política do Serviço de Saúde Pública dos EUA sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório, e o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Para e.......

Discussion

O uso de um microscópio de um ou multifótons depende das perguntas feitas, da natureza e localização do tecido a ser fotografado e da resolução necessária. Os microscópios multifotônicos baseiam-se na geração de dois ou mais fótons de baixa energia no infravermelho próximo, que podem penetrar nos tecidos em maior profundidade com menos fototoxicidade do que os microscópios de um fóton^29,30. Além disso, o fluorófo.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
488 laser	Melles-Griot	-	CW  laser 50 mW
60x PLAPON oil immersion objective (NA 1.42)	Olympus	1-U2B933	Lens Confocal microscope
633 laser	Melles-Griot	-	CW He-Ne laser 12 mW
63x objective (NA 1.40, HC PL APO CS2)	Leica	11506350	Lens Two-photon microscope
BA 410-460 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 495-540 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 505-605 nm	Chroma	-	Band-pass filter
BA 655-755 nm	Chroma	-	Band-pass filter
Boron-dipyrromethane (BODIPY) 665/676	Thermo Fisher Scientific	B3932	Lipid peroxiation sensor
Carbomer-940	Snowdrift Farm	739601480651	Gel
Catheter	Terumo	SV27EL	Winged infusion sets
Cauterizer	Braintree Scientific, Inc	GEM 5917	Cautery system
CMV-Cre mouse	Jackson lab	006054	Mouse line
Coverslip	Bioptechs	-	30mm diameter coverlip for inverted microscope
Curity 4x4 inch all purpose sponge gauze	Covidien	9024	Sponge
EGFPcyto mouse	Jackson lab	003291	Mouse line
Fiji/ImageJ software	Open source	-	Free software tool
Fine forceps	Braintree Scientific, Inc	FC003 8	Tissue forceps
Fluoview 1000 microscope	Olympus	FV1000	Confocal microscope
FluoView software	Olympus	-	Confocal microscope and Two-photon microscope
Hand-held electric razor	Braintree Scientific, Inc	CLP-8786-451A	Cordless clipper
Heat pad	Braintree Scientific, Inc	DPIP	Heat pad for animals
HyD detectors	Leica	-	Leica 4Tune spectral detector
Imaris software	Bitplane / Oxford instruments	-	Commercial software tool
Ingisht X3 tunable laser	Spectra Physics	Insight X3	Tunable Pulse-Laser
Isoflurane	VetOne	13985-046-40	Anesthetic
Ketamine	VetOne	13985-702-10	Anesthetic
LAS X Software	Leica	-	Two-photon microscope software tool
Mai-Tai tunable laser	Spectra Physics	Mai-Tai	Laser
MetaMorph	Molecular Devices	-	Commercial software tool
Monodansylpentane AUTODOT	Abcepta	Sm1000a	Lipid droplet dye
MPE-RS microscope	Olympus	IX70	Two-photon microscope
mT/mG mouse	Jackson lab	007676	Mouse line
Objective heater	Bioptechs	150819	Objective heater for both confocal and two-photon microscopes
Oxygen-saturated respiration chamber	Patterson Scientific	78933385, SAS3 and EVAC4	Gas Anesthesia and evacuation system
Parafilm	Heathrow Scientific	HS234526B	Semi-transparent, flexible, thermoplastic film
PMT detector	Olympus	-	Descanned   detectors
PMT detector	LSM-Technology	Custom built	Non-Descanned Detectors
Pump	Harvard Apparatus	703602, 704402	Nanomite injector and controller
Saline	Quality Biological	114-055-721EA	Normal saline
Sharp blunt-ended scissors	Braintree Scientific, Inc	SCT-S 508	Surgical scissors
Syringe	Covidien	22-257-150	1mL tuberculin syringe
TCS SP8 Dive Spectral microscope	Leica	SP8	Two-photon microscope
Tweezers	Braintree Scientific, Inc	FC032	Tissue forceps
Xylazine	VetOne	13985-704-10	Anesthetic