يتم دعم هذا العمل من قبل صندوق مستقبل البحوث الطبية - البحوث المعجلة ، وبعثة ماسيمو الرائدة في حثل المادة البيضاء (EPCD000034) ، وصندوق مستقبل البحوث الطبية - بعثة الخلايا الجذعية (APP2007653). يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور جو هيون لي (جامعة كوريا) على توليد البيانات في الفيديو التكميلي 1.

1. توليد عضويات الدماغ القشرية
ملاحظة: ستحدث جميع الخطوات الواردة في هذا القسم من البروتوكول في غطاء أمان أحيائي من الفئة 2، ما لم ينص على خلاف ذلك.
<ol><li>تحريض المستعمرات العصبية ثنائية الأبعاد من ثقافة hPSC ثنائية الأبعاد (أيام -1 إلى 3)<ol>
<li>قبل الحث ، قم بلوحة مستعمرات hPSC على مصفوفة غشاء سفلي مؤهل hESC في لوحة من 6 آبار بكثافة 20٪ -30٪. حقق هذه الكثافة عن طريق تمرير مستعمرات hPSC من بئر واحد من صفيحة 6 آبار عند التقاء 60٪ إلى ثلاثة آبار من صفيحة 6 آبار.</li>
		<li>بالنسبة لطلاء مصفوفة الغشاء السفلي ، قم بتخفيف مصفوفة الغشاء السفلي بنسبة 1:50 في وسط قاعدي عادي. قم بإيداع 1 مل / بئر بالتساوي من لوحة 6 آبار ، واحتضنها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) ، ثم استنشقها.</li>
		<li>الحفاظ على مستعمرات hPSC لمدة 1 يوم في 2 مل من وسط زراعة الخلايا الخالية من المصل قبل التمايز.</li>
		<li>في يوم تمايز hPSC ، افحص مستعمرات hPSC باستخدام المجهر الساطع عند تكبير 4x إلى 10x لضمان مستعمرات صحية بدون تمايز يمكن اكتشافه. ملاحظة: ستشكل hPSCs الصحية مستعمرات حافة ضيقة مع خلايا تحتوي على نواة كبيرة وسيتوبلازم صغير جدا ونواة بارزة. ستظهر مستعمرات iPSC المتباينة اختلافات مورفولوجية واضحة عن مستعمرات hPSC الموصوفة أعلاه ، خاصة حول الحواف الخارجية للمستعمرات أو في المركز.</li>
		<li>أضف الكواشف المدرجة في الجدول 1 لتكوين الوسط N2 المطلوب للتمايز. أحضر هذه الوسيلة إلى RT قبل الاستخدام.</li>
		<li>بمجرد الوصول إلى RT ، قم بشفط وسط زراعة الخلايا الخالي من المصل من كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار واستبدلها ب 2 مل من وسط N2 المضاف بلطف إلى ماصة مصلية سعة 5 مل.</li>
		<li>أضف مثبطات SMAD المزدوجة ، SB-431542 (10 ميكرومتر) و LDN 193189 (100 نانومتر). ملاحظة: يمكن إضافة مثبطات SMAD إلى وسط N2 بعد وضع الوسط في كل بئر ، أو إلى الكمية المطلوبة من وسط N2 قبل استبدال وسط زراعة الخلايا الخالي من المصل. يمكن دمج المثبطات بالتساوي في الوسط عن طريق تدوير اللوحة بلطف أو عكس الأنبوب الذي يحتوي على الوسط والمثبطات 3-4 مرات.</li>
		<li>أضف وسائط N2 جديدة مكملة ب SB-431542 (10 ميكرومتر) و LDN 193189 (100 نانومتر) يوميا إلى كل بئر خلال اليومين التاليين. ملاحظة: يضاف وسط N2 الطازج لتقليل التعرض المطول للخلايا ل DMSO الذي يستخدم لإذابة مركبات 193189 SB-431542 و LDN ومنع السمية الخلوية.</li>
	</ol></li>
	<li>جيل من الكرويات ثلاثية الأبعاد العصبية من المستعمرات العصبية الظاهرية الجلدية المستحثة ثنائية الأبعاد (الأيام 3 إلى 7)<ol>
<li>ارفع المستعمرات العصبية الخارجية المستحثة باستخدام التباعد باتباع الخطوات 1.2.2-1.2.8.</li>
		<li>أولا ، قم بإزالة 2 مل من وسط N2 من اللوحة المكونة من 6 آبار ، واغسل 1x باستخدام HBSS لضمان إزالة كل وسط N2. ملاحظة: يمكن أن يتداخل وسط N2 مع نشاط إنزيم dispase ، مما يمنع الانفصال الكافي للمستعمرات العصبية الخارجية عن البئر.</li>
		<li>أضف 1 مل من 2.4 وحدة / مل إلى كل بئر يحتوي على مستعمرة.</li>
		<li>احتضن البئر لمدة 20-25 دقيقة (بحد أقصى 30 دقيقة) عند 37 درجة مئوية. تحقق من وجود مفرزة مستعمرة بانتظام. ملاحظة: قد تنفصل المستعمرات الصغيرة في غضون 20 دقيقة. يجب تجاهل أي مستعمرات تظل عالقة بعد 30 دقيقة.</li>
		<li>بعد الحضانة ، أضف 1 مل من وسط N2 إلى البئر لوقف نشاط إنزيم dispase ونقل المستعمرات إلى أنبوب 15 مل باستخدام طرف ماصة P1000 واسع التجويف أو طرف ماصة P1000 معدل مقطوع بمقص معقم (مما يجعله طرف P1000 واسع التجويف).</li>
		<li>اسمح لكتل المستعمرة بالغرق في قاع الأنبوب بالجاذبية. ملاحظة: ستستغرق هذه العملية حوالي 1 دقيقة.</li>
		<li>بمجرد غرق الكتل ، قم بإزالة supernatant بعناية باستخدام طرف ماصة P1000 قياسي واستبدله ب 1 مل من وسط N2 الطازج. كرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات لضمان الإزالة الكاملة للديسباس. ملاحظة: أي تباعد متبق سيمنع تكوينا موحدا للكرويات العصبية والجلدية ويحفز موت الخلايا.</li>
		<li>بعد الغسيل ، أعد تعليق كتل الخلايا في 3 مل من وسط N2 ونقلها إلى بئر واحد من صفيحة 6 آبار وأضف 40 نانوغرام / مل من bFGF. ملاحظة: إذا تم فصل عدد كبير من مستعمرات الجلد العصبي ، فيمكن طلاء هذه المستعمرات عبر بئرين أو أكثر من صفيحة 6 آبار لمنع اندماج الكرويات. 24 ساعة بعد انفصال مفرزة المستعمرات ، تحقق مما إذا كانت الكرويات قد تشكلت.</li>
		<li>حافظ على الكرويات في نفس الوسائط لمدة 3-4 أيام قادمة ولكن أضف bFGF طازجا (40 نانوغرام / مل) إلى كل بئر يوميا لتعزيز انتشار الخلايا العصبية والجلدية ، والتنظيم الذاتي ، وتحفيز وتوسيع الظهارة العصبية. ملاحظة: إذا تم طلاء الكرويات بكثافة أعلى ، فمن المحتمل أن تتحول الوسائط إلى اللون الأصفر وتتطلب استبدالها كل 2 أيام ب bFGF طازج (40 نانوغرام / مل). ومع ذلك ، لا ينصح بذلك ، وبدلا من ذلك ، يجب الحفاظ على عدد أقل من الكرويات في كل بئر لتجنب هذه المشكلة. يمكن تضمين الكرويات في مصفوفة الغشاء السفلي بعد 3 أيام إذا كانت الظهارة العصبية واضحة. إذا لم تكن الظهارة العصبية واضحة أو لا تبدو قوية ، فحافظ على الكرويات ليوم آخر وتحقق مرة أخرى.</li>
	</ol></li>
	<li>تمايز الدماغ العضوي القشري وصيانته (اليوم 8)<ol>
<li>إعداد وسائط التمايز الطرفي (DM) باستخدام الكواشف المدرجة في الجدول 2. أحضر هذه الوسائط إلى RT.</li>
		<li>قم بإذابة مصفوفة الغشاء السفلي المؤهل بنسبة 100٪ من hESC على الجليد.</li>
		<li>قم بإعداد ورقة من البارافيلم مع الدمامل المعقمة بنسبة 70٪ من الإيثانول في طبق بتري 10 سم ووضعها على مجهر ستيريو تحت غطاء محرك السيارة. ملاحظة: يمكن استخدام صينية فارغة من أطراف ماصة 200 ميكرولتر لإنشاء شبكة من الغمازات.</li>
		<li>اقطع الطرف من طرف ماصة 100 ميكرولتر (لجعله واسع التجويف). سيتم استخدام هذا لتضمين الكرويات العصبية في مصفوفة الطابق السفلي دون كسرها.</li>
		<li>باستخدام المجهر المجسم، اختر كرويات عصبية متشابهة الحجم (500 ميكرومتر) من الصفيحة المكونة من 6 آبار وانقلها إلى الدمامل شبه السينمائية باستخدام طرف ماصة 100 ميكرولتر واسع التجويف، ووضع كروي عصبي واحد لكل دملة.</li>
		<li>قم بإزالة أي وسائط زائدة بلطف ، مع ترك ما يكفي لتغطية الكرويات. ملاحظة: هذا هو للحفاظ على جودة الكروية قبل إضافة مصفوفة الطابق السفلي وضمان عدم جفافها.</li>
		<li>أضف بلطف 18 ميكرولتر من مصفوفة الطابق السفلي فوق الكروية ، مع وضع الكروي داخل مركز قطرة المصفوفة. استخدم نهاية طرف ماصة 10 ميكرولتر لتوسيط الكرويات في المصفوفة. ملاحظة: حاول إضافة مصفوفة الطابق السفلي في أسرع وقت ممكن لتجنب جفاف الوسائط الزائدة حول الكرويات.</li>
		<li>قم بتغطية طبق بتري 10 سم وانقله إلى الحاضنة واحتضن طبق البارافيلم مع كرويات مدمجة في مصفوفة الطابق السفلي عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.</li>
		<li>بعد الحضانة، اشطف الكرويات المدمجة في صفيحة منخفضة التركيب ذات 24 بئرا باستخدام طرف P1000 مع 0.5 مل من وسائط DM، مع التأكد من وضع الكرويات المدمجة الفردية في بئر واحد لكل منها. ملاحظة: إذا سقط أكثر من كروي مضمن في بئر واحد، فاستخدم طرف P1000 عريض التجويف لنقل الكروي الآخر إلى بئر جديد.</li>
		<li>الحفاظ على عضويات الدماغ القشرية المتمايزة في وسائط DM لفترات طويلة من الزمن ، مع حدوث تغييرات في الوسائط كل 2 أيام عندما تصبح المواد العضوية أكبر وأكبر. ملاحظة: خلال الأسبوع الأول من التمايز ، يمكن تغيير الوسيط كل 3 أيام.</li>
	</ol></li>
</ol>2. توصيف الشيخوخة العصبية في المواد العضوية القشرية
<ol><li>معالجة المواد العضوية القشرية للعمليات التبريدية: ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات في غطاء محرك السيارة للسلامة الأحيائية من الفئة 2.<ol>
<li>تحضير أنابيب 2 مل ، كل منها مملوء ب 1.5 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA).</li>
		<li>اقطع نهاية طرف ماصة P1000 (لجعله تجويف واسع) وانقل بلطف كل عضو عضوي إلى أحد أنابيب 2 مل المحضرة أعلاه (واحد عضوي لكل أنبوب). ملاحظة: لمنع الاختلاط الزائد لوسائط DM مع PFA، اسمح للعضوي بالغرق نحو فتحة طرف الماصة P1000 وقم بإراحة الطرف فوق الجزء العلوي من PFA مباشرة في الأنبوب قبل سحب العضو إلى الخارج. هذا سيمكن الباحث من نقل الوسائط العضوية والحد الأدنى جدا من الوسائط.</li>
		<li>اسمح لعملية التثبيت أن تتم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.</li>
		<li>باستخدام طرف ماصة P1000 غير مقطوع ، قم بشفط PFA الزائد بعناية وأضف 1.5 مل من PBS 1x البارد.</li>
		<li>انقل الأنابيب إلى شاكر مداري تم ضبطه عند 70 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في RT.</li>
		<li>كرر عملية الغسيل باستخدام 1x PBS البارد ثلاث مرات لضمان إزالة جميع PFA تماما. ملاحظة: لا تتخلص من PFA في حاويات النفايات العادية. بدلا من ذلك ، قم بإعداد حاوية محددة للتخلص من النفايات الكيميائية لهذا الغرض ، لأن PFA يشكل خطرا.</li>
		<li>اغمر المواد العضوية في 1x PBS التي تحتوي على 30٪ من السكروز واحتضنها عند 4 درجات مئوية حتى تغرق جميع المواد العضوية في قاع الأنبوب. ملاحظة: يعتمد الوقت اللازم للسماح للعضويات بالغرق على حجم/عمر المواد العضوية. قد تستغرق المواد العضوية البالغة من العمر 3 أشهر ما يصل إلى 5 ساعات.</li>
		<li>باستخدام طرف ماصة P1000 واسع التجويف ، انقل بلطف ثلاثة إلى خمسة عضويات إلى قالب تركيب يحتوي على محلول تركيب مصنوع من 30٪ سكروز و 100٪ من درجة حرارة القطع المثلى (OCT) المتوسطة ، بنسبة 3: 2.</li>
		<li>استخدم طرف ماصة 10 ميكرولتر بمساعدة مجهر مجسم لتوجيه المواد العضوية ووضعها في نمط يشبه الشبكة.</li>
		<li>ضع القالب على الثلج الجاف لتصلب محلول السكروز OCT قبل الشروع في التقسيم المبرد (16-20 ميكرومتر) باستخدام الكريستات. ملاحظة: بالنسبة للبيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة ، يجب معالجة جميع الأنسجة للتقسيم بمجرد غرقها. بالنسبة للتألق المناعي ، يمكن معالجة الأنسجة للتقسيم في اليوم التالي. يجب تخزين جميع الشرائح التي تحتوي على أقسام عند -20 درجة مئوية قبل التألق المناعي اللاحق أو بيتا غالاكتوزيداز ، إذا لم تكن ملطخة على الفور.</li>
	</ol>
</li>
	<li>عملية تحليل الشيخوخة في عضويات الدماغ القشرية : ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات التالية على مقعد المختبر العادي.<ol>
<li>انقل الشرائح إلى حاوية تلطيخ شرائح المجهر بغطاء واغسل الأنسجة العضوية المجزأة ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لمدة 10 دقائق في RT لإزالة أي محلول تركيب زائد.</li>
		<li>بعد ذلك ، احتضن الأنسجة المغسولة بمحلول تلطيخ بيتا غالاكتوزيداز الطازج بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: يتكون محلول تلطيخ بيتا غالاكتوزيداز من مخزن فوسفات مؤقت (ل 10 مل من المخزن المؤقت للفوسفات: 8.15 مل من 1 M NaH 2 PO 4 ، 1.85 مل من 1M Na 2 HPO4) معدل الأس الهيدروجيني = 6 ، 100 mM من سداسي أسيانوفارات البوتاسيوم (III) ، 100 mM من سداسي أسيانوفيرات البوتاسيوم (II) ثلاثي الهيدرات ، 5 M من كلوريد الصوديوم ، 1 M من MgCl2، 20 ملغم/مل من X-Gal. تجنب استخدام حاضنة زراعة الخلايا القياسية التي تحتوي على CO 2 لأن CO2 سيغير درجة الحموضة في محلول تلطيخ بيتا غالاكتوزيداز.</li>
		<li>اغسل الأنسجة الملطخة ب 1x PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في RT لإزالة محلول بيتا غالاكتوزيداز.</li>
		<li>قم بتركيب الأنسجة المغسولة باستخدام حامل زجاجي مضاد للتلاشي واسمح لمحلول التركيب بالتصلب لمدة 30 دقيقة في RT قبل المشاهدة تحت المجهر.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+regionally+specified+hPSC-derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration.">Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).</li><li>Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., L&#233;vi-Strauss, J., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fused+cerebral+organoids+model+interactions+between+brain+regions.">Fused cerebral organoids model interactions between brain regions.</a> Nature Methods. 14 (7), 743 (2017).</li><li>Kwak, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+homogeneous+midbrain+organoids+with+in+vivo-like+cellular+composition+facilitates+neurotoxin-based+Parkinson's+disease+modeling.">Generation of homogeneous midbrain organoids with in vivo-like cellular composition facilitates neurotoxin-based Parkinson's disease modeling.</a> Stem Cells. 38 (6), 727-740 (2020).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region-specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Shaker, M. R., Cooper-White, J., Wolvetang, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+3D+human+choroid+plexus-ventricle-cortical+organoids.">Self-organizing 3D human choroid plexus-ventricle-cortical organoids.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Shaker, M. R., Aguado, J., Chaggar, H. K., Wolvetang, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klotho+inhibits+neuronal+senescence+in+human+brain+organoids.">Klotho inhibits neuronal senescence in human brain organoids.</a> npj Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 1-12 (2021).</li><li>Shaker, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anteroposterior+Wnt-RA+gradient+defines+adhesion+and+migration+properties+of+neural+progenitors+in+developing+spinal+cord.">Anteroposterior Wnt-RA gradient defines adhesion and migration properties of neural progenitors in developing spinal cord.</a> Stem Cell Reports. 15 (4), 898-911 (2020).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Shaker, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+generation+of+myelinating+human+oligodendrocytes+in+organoids.">Rapid and efficient generation of myelinating human oligodendrocytes in organoids.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 631548 (2021).</li><li>Lee, J. -. H., Shaker, M. R., Lee, E., Lee, B., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuroCore+formation+during+differentiation+of+neurospheres+of+mouse+embryonic+neural+stem+cells.">NeuroCore formation during differentiation of neurospheres of mouse embryonic neural stem cells.</a> Stem Cell Research. 34, 101691 (2020).</li><li>Shaker, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+contribution+of+neuromesodermal+progenitor-derived+neural+cells+in+the+elongation+of+developing+mouse+spinal+cord.">Spatiotemporal contribution of neuromesodermal progenitor-derived neural cells in the elongation of developing mouse spinal cord.</a> Life Sciences. 282, 119393 (2021).</li><li>Shaker, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+epidermal+growth+factor-like+like+protein+2+Is+expressed+in+human+oligodendroglial+cell+types.">Neural epidermal growth factor-like like protein 2 Is expressed in human oligodendroglial cell types.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 803061 (2022).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+culture+of+advanced+cerebral+organoids+for+studying+later+stages+of+neural+development.">Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development.</a> Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).</li><li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-region-specific+organoids+using+mini-bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure.">Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Hunter, Z. L., Leeson, H. C., Shaker, M. R., Wolvetang, E. J., Vadlamudi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+epilepsy+patients+for+use+as+in+vitro+models+for+drug+screening.">Human induced pluripotent stem cells generated from epilepsy patients for use as in vitro models for drug screening.</a> Stem Cell Research. 60, 102673 (2022).</li><li>Kaur, A., Macip, S., Stover, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+appraisal+on+the+value+of+using+nutraceutical+based+senolytics+and+senostatics+in+aging.">An appraisal on the value of using nutraceutical based senolytics and senostatics in aging.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 218 (2020).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+dispase+and+plasmin+in+pharmacologic+vitreolysis.">Safety and efficacy of dispase and plasmin in pharmacologic vitreolysis.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (9), 3286-3290 (2004).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

لتمكين استخدام المواد العضوية الدماغية المشتقة من hPSC في فحص الأدوية ونمذجة الأمراض ، من الأهمية بمكان صنع المواد العضوية باتباع بروتوكول15 قابل للتكرار وموثوق به. عادة ما يتم توليد عضويات الدماغ من الأجسام الجنينية المشتقة من hPSCs ، والتي يتم تضمينها بعد ذلك في مصفوفة خارج الخلية تعزز توسع الأنسجة والتمايز العصبي. عند مقارنتها ببروتوكولات مثل لانكستر1،16،17 و Velasco18 ، والتي تبدأ من الأجسام الجنينية وتسمح بمسار التمايز الافتراضي الذي تتبعه المواد العضوية النامية ، وجدنا أن البدء في إنشاء عضويات الدماغ القشرية مع خلايا NEct البشرية بدلا من الأجسام الجنينية يحسن اتساق تكوين العضوية القشرية في الدماغ. وبالتالي يسمح هذا أيضا بالتحجيم المطلوب لفحص الأدوية والنمط الظاهري. نظرا لأنه لا يمكن توسيع خلايا NEct البشرية إلى كميات كبيرة فحسب ، بل يمكن أيضا حفظها بالتجميد بسهولة ، فإن هذا النهج يحسن أيضا من قابلية التكرار بين التجارب. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه بالمقارنة مع البروتوكولات الأخرى التي اعتمدت استخدام المفاعلات الحيوية والتكنولوجيات المماثلة، لا توجد حاجة إلى معدات متخصصة لهذا البروتوكول، مما يجعله مناسبا لأي مختبر6. وأخيرا ، يتم تقليل الوقت اللازم لتوليد المواد العضوية الناضجة التي تكون إيجابية لعلامات الطبقة القشرية مثل SATB2 مقارنة بكل من بروتوكولات لانكستر 1 والمفاعل الحيوي 6,19 مما يجعلها أكثر ملاءمة لدراسة المسار التنموي لتطور القشرة البشرية في الصحة والأمراض 1,6,16.
وعلاوة على ذلك، وبالنظر إلى تأثير الرعاية الصحية العالمية المتزايد باستمرار للأمراض المرتبطة بالشيخوخة مثل الخرف، والتي ترتبط بزيادة أنواع الخلايا الشائخة في الدماغ التي تسهم في الإمراض، فإن القدرة على تحديد واختبار المركبات التي يمكن أن تخفف من شيخوخة الدماغ هي ذات أهمية هائلة. على الرغم من أنه من المعروف أن hPSCs يتم تجديدها بشكل لاجيني خلال عملية إعادة البرمجة20 ، إلا أننا نجد زيادات قوية في الخلايا الشائخة في عضويات الدماغ القشرية المزروعة لفترات طويلة من الزمن. هذا تطور واعد يمكن الآن من فحص الأدوية التي تقضي على هذه الخلايا الشائخة من الدماغ (senolytics) أو التي تبطئ هذه العملية (senostatics)21. وبما أن عضويات الدماغ القشرية المشتقة من NEct البشري هي من أصل بشري ، فمن المرجح أن يؤدي هذا النهج إلى تقصير المسار التقليدي لتسويق مثل هذه العلاجات الجديدة.
هناك خطوتان حاسمتان في هذا البروتوكول. الأول هو المستوى الصحيح من التقاء مستعمرات hPSC في وقت التمايز. يجب أن تكون مستعمرات hPSC ملتقية بنسبة 30٪ على الأكثر لضمان عدم اندماج مستعمرات NEct المتولدة مع المستعمرات المجاورة وأن تكون المواد العضوية الفردية مدفوعة باستنساخ. تتضمن الخطوة الحرجة الثانية الاستخدام الصحيح للديسباز لرفع مستعمرات NEct وإنتاج الكرويات العصبية. توقيت الحضانة مع dispase أمر بالغ الأهمية للجودة النهائية للكرويات العصبية المتولدة. وذلك لأن التعرض المفرط للمستعمرات مع dispase سام للخلايا22 ويؤثر في النهاية على جودة المواد العضوية المتولدة. الحد من هذا البروتوكول هو أنه من الصعب التحكم في حجم الكرويات العصبية لأنه يعتمد على حجم المستعمرات الأولية التي يتم رفعها مع dispase. ومع ذلك ، يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق اختيار الكرويات العصبية ذات الحجم المماثل عند المتابعة إلى مرحلة التضمين.
وأخيرا، يمكن أن تمتد التطبيقات المستقبلية إلى استخدام هذه المواد العضوية القشرية القابلة للتكرار في التحليل الروبوتي ونهج الفحص الصيدلاني الحيوي المستخدمة عادة في تلك الصناعة. ويدعم ذلك بيانات أولية من مختبرنا تشير إلى أن توليد عضويات الدماغ القشرية من خلايا NEct البشرية يمكن أن يكون آليا بسهولة ، مما يجعله متوافقا مع هذه الأساليب.

استندت معرفتنا الحالية بالدماغ البشري إلى حد كبير على النماذج الحيوانية وعينات الدماغ بعد الوفاة. بيولوجيا الخلايا الجذعية هو مجال سريع التقدم يوفر رؤى جديدة في البيولوجيا الأساسية لنمو الدماغ البشري والدوافع المرضية لاضطرابات الدماغ البشري. الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) هي أداة لا تقدر بثمن لنمذجة الدماغ البشري عن طريق توليد المواد العضوية ، والأنسجة ثلاثية الأبعاد (3D) الشبيهة بالأعضاء التي تلخص عادة مسارات النمو ، والتركيب الخلوي ، وبنية الدماغ البشري النامي. يتم تجميع عضويات الدماغ ذاتيا وتتكون من خلايا جذعية عصبية ، وأسلاف عصبيين محددين ، وخلايا عصبية ناضجة ، وأنواع الخلايا الدبقية. وبالتالي ، توفر المواد العضوية فرصة فريدة لدراسة الدماغ البشري المبكر ، والذي غالبا ما يتعذر الوصول إليه لإجراء تجارب مباشرة ولكن له أيضا قيود جوهرية مثل عدم وجود الأوعية الدموية والجهاز المناعي.
تم اتباع منهجيات لتوليد المواد العضوية في الدماغ بطريقتين مختلفتين: التمايز غير الموجه والموجه. تعتمد طرق الدماغ العضوية غير الموجهة على قدرات التمايز الجوهرية التلقائية للخلايا الجذعية التي تدفع تكوين الأنسجة 1,2 وتسمح بظهور مجموعة متنوعة من هويات نسب الخلايا التي تتراوح من الدماغ الأمامي والدماغ المتوسط والدماغ الخلفي إلى الضفيرة المشيمية والشبكية والأديم المتوسط. في المقابل ، تتطلب طرق الدماغ العضوية الموجهة استخداما كبيرا للعوامل الخارجية لدفع hPSCs نحو النمط المطلوب للسلالات العصبية التي تمثل نوعا واحدا من مناطق الدماغ ، مثل البروز العقدي الإنسي3 ، والدماغ الأمامي4 ، والدماغ المتوسط5 ، وتحت المهاد6 ، والمخيخ7 ، والضفيرة المشيمية8. هذه القدرة على توليد مناطق مختلفة من الدماغ مع سلالات خلايا مختلفة ، وإمكانية دمجها حسب الرغبة ، تجعل من عضويات الدماغ نموذجا ممتازا للتحقيق في نمو الدماغ البشري وفك رموز الآليات الأساسية للأمراض المرتبطة بالدماغ. على الرغم من أن هذه الطرق لتوليد المواد العضوية في الدماغ تقدم طفرة في نمذجة مناطق الدماغ البشري ، إلا أن التباين وعدم التجانس بين المواد العضوية لا يزالان يشكلان قيدا كبيرا على الدراسات المنهجية والكمية ، مثل فحص الأدوية.
يعتمد البروتوكول الحالي على طريقة تم تطويرها في ورقتنا البحثية الأخيرة9 وتتضمن التمايز الانتقائي لمستعمرات hPSC نحو هوية الأديم العصبي (NEct) مع مثبطات SMAD المزدوجة (SB-431542 و LDN 193189) ، والتي لديها بعد ذلك القدرة على التنظيم الذاتي في غضون 4 أيام في كرويات الظهارة العصبية ثلاثية الأبعاد تحت تأثير إشارات FGF2. تولد هذه الظهارة العصبية كروية بشكل موثوق عضويات قشرية متجانسة مع تركيبة خلوية تشبه الجسم الحي في غضون 4 أسابيع من التمايز. البروتوكول الموصوف هنا مبني على النتائج السابقة التي توصلنا إليها والتي تبين أن تثبيط إشارات SMAD المزدوجة (مثبط الأمهات ضد Decapentaplegic) يعزز تمايز hPSCs نحو الخلايا الجذعية العصبية السطحية المشتقة من أسلاف الجلد العصبيالخارجي 10 عن طريق ، من بين أمور أخرى ، تثبيط اختيار مصير خلايا الجلد الباطن والجلد المتوسط والأديم التغذي11 . علاوة على ذلك ، فإن تضمين كرويات الظهارة العصبية في مصفوفة الغشاء السفلي المؤهل من قبل hESC يؤدي إلى ظهور كبير في الظهارة العصبية ، مما يشكل البطينين مع قطبية أبيكوبازية. أظهرت الثقافة واسعة النطاق قابلية التكاثر والتجانس للعضويات القشرية المستقلة عن خطوط الخلايا أو المستنسخات أو الدفعات ، وبالتالي تمثل نظاما موثوقا ومستقرا للخلايا الجذعية لمحاكاة التطور القشري البشري المبكر في الصحة والمرض في المختبر. كما أننا نحدد بروتوكولا للكشف عن علامات الخلايا العصبية الشائخة في عضويات الدماغ القشرية المشتقة من hPSCs والتي تم زراعتها لفترات طويلة من الزمن.
بعد طلاء hPSCs بكثافة بذر تتراوح بين 20٪ و 30٪ ، يتم التعامل مع الخلايا بمثبطات SMAD المزدوجة لمدة 3 أيام لتمييز مستعمرات hPSC نحو مستعمرات الجلد العصبي. ثم يتم رفع هذه المستعمرات بلطف مع dispase وبذورها في لوحات 6-well منخفضة للغاية المرفقة مع استكمال FGF2. المستعمرات العائمة ثنائية الأبعاد تنظم نفسها ذاتيا في كرويات ثلاثية الأبعاد عصبية بين عشية وضحاها ويتم الحفاظ عليها لمدة 4 أيام في وسط N2 تستكمل يوميا مع FGF2. بمجرد أن تنشئ الكرويات الطبقة الظهارية العصبية ، يمكن تضمينها في مصفوفة الغشاء السفلي. من خلال إضافة وسط تمايز طرفي جديد بشكل روتيني ، سيلاحظ الباحثون التوسع التدريجي والبهار الظهاري العصبي في المواد العضوية القشرية . قد يرغب الباحثون في فصل هذه المواد العضوية لإجراء التنميط النسخي والبروتيني. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بالتصوير الساطع لمراقبة جودة المواد العضوية القشرية . يمكن إجراء التحليل عن طريق التثبيت والاستئصال بالتبريد والتلطيخ المناعي. وقد سبق وصف أوصاف وأساليب هذه التقنيات12. في نهاية المطاف ، يسمح هذا البروتوكول للباحثين بتوليد عضويات دماغية قشرية متجانسة بسرعة وقوة لنمذجة الدماغ القشري البشري النامي ، بتكلفة منخفضة ومعدات محدودة ، ولدراسة جوانب الشيخوخة العصبية الخلوية ، كما هو موضح في هذه الورقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde (W/V) Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>4% of PFA are diluted in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol 50 mL(1000x)</td>
			<td>Life Technologies Australia (TFS)</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Used in NM and DM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B 27 Supplement 10 mL</td>
			<td>Life Technologies Australia (TFS)</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Used in NM and DM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX53 microscope with SC50 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 6 well cell culture plates</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>CLS3516-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Powder is dissolve in HBSS, filtered through 0.22 &#181;m filter, aliquote at 10 mL and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Nutrient Mix F12 10x 500 mL (DMEM/F-12)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11320082</td>
			<td>Used in NM and DM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Matrigel hESC-qualified Matrix</td>
			<td>In Vitro Technologies Pty Ltd</td>
			<td>FAL354277</td>
			<td>Make aliquotes of 100 &#181;L and stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement 100x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Used in NM and DM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cells (EU79)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house reporogrammed from skin fibroblast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cells (G22)</td>
			<td>Genea Biocells</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Genea Biocells (San Diego, United States)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human induced pluripotent stem cells (WTC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Professor Bruce Conklin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution TGF-&#914; RI Kinase Inhibitor VI, SB431542</td>
			<td>Merck</td>
			<td>US1616464-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Solution Human Recombinant</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>I9278</td>
			<td>Used in NM and DM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189 Dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>SML0559-5MG</td>
			<td>Used during differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Used in NM and DM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>100-0276</td>
			<td>Used to maintain hiPSC colonies prior to differentiation with NM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement 5 mL (100x)</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Used in NM and DM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Used in DM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Embedding Compound Sakura Clear (118 mL/Bottle)</td>
			<td>Tissue Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Roll Size 4 in. x 125 Ft</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used in NM and DM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hexacyanoferrate (II) Trihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>CP1087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>455946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies Australia (TFS)</td>
			<td>P36980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-01M</td>
			<td>Aliquotes are made at 20 &#181;g/mL and stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614</td>
			<td>Used during differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>&#160;PHR1001-1G</td>
			<td>30% of sucrose are diluted in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low attachment multiwell plates , 24 well plate, polystyrene</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>CLS3473-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-GAL EA</td>
			<td>Life Technologies Australia (TFS)</td>
			<td>R0404</td>
			<td>Make aliquotes of 20 mg/mL and storde at -80 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust and highly reproducible generation of cortical brain organoids for modelling brain neuronal senescence in vitro

العضوية الدماغية هي نماذج ثلاثية الأبعاد للدماغ البشري النامي وتوفر منصة مقنعة ومتطورة لنمذجة الأمراض والفحص الجيني والأدوية على نطاق واسع. نظرا لطبيعة التنظيم الذاتي للخلايا في المواد العضوية في الدماغ والمجموعة المتزايدة من البروتوكولات المتاحة لتوليدها ، تم تحديد المشكلات المتعلقة بعدم التجانس والتباين بين المواد العضوية. في ورقة البروتوكول هذه ، نصف بروتوكولا قويا وقابلا للتكرار يتغلب إلى حد كبير على هذه المشكلات ويولد عضويات قشرية من أسلاف الجلد العصبي في غضون شهر 1 ، ويمكن الحفاظ عليه لأكثر من 1 سنة. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول القابل للتكرار بسهولة في غرفة زراعة الأنسجة القياسية وينتج عنه عضويات مع تنوع غني من أنواع الخلايا الموجودة عادة في القشرة البشرية النامية. على الرغم من تركيبتها التنموية المبكرة ، ستبدأ الخلايا العصبية وأنواع خلايا الدماغ البشرية الأخرى في إظهار العلامات النموذجية للشيخوخة في الخلايا العصبية بعد فترة طويلة من الثقافة المخبرية ، مما يجعلها منصة قيمة ومفيدة لدراسة العمليات العصبية المرتبطة بالشيخوخة. يحدد هذا البروتوكول أيضا طريقة للكشف عن هذه الخلايا الشائخة في عضويات الدماغ القشرية باستخدام تلطيخ بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة.

Watch this Scientific Journal Video about Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro at JoVE.com

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

في هذه الدراسة ، نقدم تقنية مفصلة لنظام زراعة عضوي قشري بسيط ولكنه قوي باستخدام ثقافات hPSC القياسية الخالية من التغذية. هذا بروتوكول سريع وفعال وقابل للتكرار لتوليد المواد العضوية التي تشكل جوانب شيخوخة الدماغ في المختبر.

جيل قوي وقابل للتكرار للغاية من عضويات الدماغ القشرية لنمذجة الشيخوخة العصبية الدماغية في المختبر

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and ...

يعالج هذا البروتوكول بعض القضايا الرئيسية الموجودة في توليد المواد العضوية مثل المتانة والموثوقية ، وتمكنا من تطبيق هذه المواد العضوية المحسنة على الأبحاث المبتكرة حول الشيخوخة العصبية. عدم التجانس والتكاثر هي قضايا مهمة عند توليد عضويات الدماغ القشرية . للتغلب على هذه ، نقوم أولا بتمييز hPSCs إلى مستعمرات عصبية خارجية ثم كرويات ظهارية عصبية ، والتي تولد بنية أنسجة قابلة للتكرار.تبدأ هذه المواد العضوية القشرية في الدماغ في إظهار علامات نموذجية للشيخوخة بعد زراعة طويلة في المختبر ، مما يجعلها منصة مفيدة لدراسة العمليات العصبية المرتبطة بالشيخوخة. للبدء ، قم بلوحة مستعمرات hPSC على مصفوفة غشاء قبو مؤهل hESC من بئر واحد من لوحة من ستة آبار عند التقاء 60٪ في ثلاثة آبار لتحقيق كثافة 20 إلى 30٪ ثم المضي قدما في تحريض المستعمرات العصبية ثنائية الأبعاد. أضف وسيط N2 طازجا مكمل بمثبطات SMAD مزدوجة يوميا إلى كل بئر خلال الأيام الثلاثة القادمة.لتوليد كرويات ثلاثية الأبعاد عصبية خارجية الجلد من مستعمرات ثنائية الجلد العصبية المستحثة ، قم بإزالة ملليلتر من وسط N2 من لوحة البئر الستة واغسلها مرة واحدة باستخدام HBSS لضمان إزالة كل وسط N2. أضف ملليلتر واحد من dispase إلى كل مستعمرة تحتوي على بئر. احتضن الطبق لمدة 20 إلى 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية وتحقق من انفصال المستعمرة بانتظام.في نهاية الحضانة ، لوقف نشاط إنزيم dispase ، أضف ملليلتر واحد من وسط N2 إلى البئر. باستخدام طرف ماصة P1000 واسع التجويف أو طرف ماصة P1000 معدل مقطوع بمقص معقم ، انقل المستعمرات إلى أنبوب 15 ملليلتر واسمح لكتل المستعمرة بالغرق في قاع الأنبوب بجاذبية. ثم باستخدام طرف ماصة P1000 قياسي ، قم بإزالة السوبرناتانت بعناية.استبدله بملليلتر واحد من وسط N2 الطازج وكرر الغسيل ثلاث مرات لضمان الإزالة الكاملة للديسباس. بعد تعليق كتل الخلايا ووسط N2 ، انقل تعليق الخلية إلى بئر واحد من صفيحة البئر الستة وأضف 40 نانوغرام لكل ملليلتر من bFGF. بعد التقسيم المبرد للعضويات ، قم بإزالة محلول التركيب الزائد عن طريق نقل الشرائح إلى حاوية تلطيخ الشرائح بغطاء وغسل الأنسجة العضوية المجزأة ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.ثم احتضن الشرائح بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية باستخدام محلول تلطيخ بيتا غالاكتوزيداز الطازج. اغسل الأنسجة الملطخة ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة لإزالة محلول بيتا غالاكتوزيداز. الآن قم بتركيب الأنسجة المغسولة باستخدام حامل زجاجي مضاد للتلاشي واسمح لمحلول التركيب بالتصلب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل مشاهدته تحت المجهر.قبل التمايز العصبي الخارجي ، أظهرت مستعمرات hPSC مورفولوجيا أحادية الطبقة مسطحة ضيقة دون خلايا متمايزة تلوث المستعمرات. أكد تعبير NANOG أيضا تعدد قدرات مستعمرات hPSC. بعد تمايز مستعمرات hPSC إلى مستعمرات عصبية ، لوحظ مورفولوجيا أطول على شكل عمود ، وكانت سلبية ل NANOG.بعد العلاج المنفصل والتعرض ل FGF2 في N2 ، تكاثرت الخلايا الجذعية العصبية في هذه الكرويات وشكلت عددا كبيرا من الورود العصبية التي أظهرت القطبية القمية القاعدية للكروية عن طريق التعبير عن Z01 في الخلايا في المركز والحافة الخارجية للكروية. بمجرد تضمينه ، يتكاثر الكروي بسرعة ويبدأ في التبرعم ، كما يتضح من وجود عقد الأنسجة المدمجة وتمددها إلى الخارج من الجسم الرئيسي بين أسبوع إلى ثلاثة أسابيع ، وهو ما أكده التحليل الكمي وزاد قطر الكروية بشكل كبير على مدى ثلاثة أسابيع. أكد تلطيخ التألق المناعي وجود خلايا السلف العصبية وعلامات الطبقة القشرية في المواد العضوية ذات الطبقات الواضحة ، والتي كان يمكن ملاحظتها عبر نقاط زمنية مختلفة.كما تمت دراسة تأثير العمليات المتعلقة بالشيخوخة العصبية على الدماغ. مع مرور الوقت ، لوحظت زيادة كبيرة في وجود الشيخوخة المرتبطة بيتا غالاكتوزيداز وفي الأسبوع 13 ، تم الكشف عن وجود p21 ، مما يدل على الشيخوخة. من المهم التأكد من إزالة جميع الفراغات الزائدة وفصل المستعمرات العصبية الجلدية السليمة وإعادة زرعها بلطف لتشكيل كرويات صحية.هذه المنصة من فرصتنا الفريدة لدراسة بيولوجيا شيخوخة الدماغ البشري ، كما أنها تسمح بإجراء بحث حول تطور الدماغ الحرج ، شريطة أن يتم استزراع هذه المواد العضوية باستخدام مفاعل حيوي.

robust-highly-reproducible-generation-cortical-brain-organoids-for

جيل قوي وقابل للتكرار للغاية من عضويات الدماغ القشرية لنمذجة الشيخوخة العصبية الدماغية في المختبر

Abstract