עבודה זו מומנה על ידי קרן קנדיס.

כל הליכי הטיפול והניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך הקהילה האירופית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (2010/63/UE). עכברי C57BL/6JBomTac זכרים, בני 10 שבועות, ועכברי ספראג דאולי זכרים, בני 10 שבועות, שימשו להדגמת פרוטוקול זה.
1. הכנת הנוזל הבין-תאי הסינתטי
<ol><li>הכינו נוזל אינטרסטיציאלי סינתטי (SIF) על פי המתכון הבא: 108 mM NaCl, 3.48 mM KCl, 3.50 mM MgSO 4, 26 mM NaHCO3, 11.70 mM NaH 2 PO4, 1.50 mM CaCl2, 9.60 mM Na-gluconate, 5.50 mM גלוקוז ו-7.60 mM סוכרוז (ראו טבלת חומרים). הערה: SIF יכול להיות מגוון בהתאם ליעד הגירוי, למשל, ניתן להשתמש בתמיסה נטולת סידן בעת חקר תעלות סידן.</li>
	<li>התאימו את ה-pH ל-7.4 וייצבו את ה-pH על ידי גז קרבוגן (5% CO 2 ו-95% O2)46.</li>
</ol>2. המתת חסד
<ol><li>הרדימו עכברים וחולדות בוגרים בתערובת של 70% CO 2 ו-30% O2. ערפו עכברים באמצעות זוג מספריים וחולדות באמצעות גיליוטינה (ראו טבלת חומרים). הערה: השתמש בזן ובגיל המתאימים למטרת המחקר. גם זכרים וגם נקבות יכולים לשמש במודל זה.</li>
	<li>הפרד את הראש מהגוף ברמת C3-C4 של חוט השדרה. הערה: המתת חסד יכולה להתבצע גם עם הזרקה תוך-צפקית של פנטוברביטל (100-150 מ"ג/ק"ג).</li>
</ol>3. דיסקציה
<ol><li>הכינו את רקמת החולדה לפי השלבים הבאים.<ol><li>הסר את העור ואת השריר סביב הראש והצוואר באמצעות זוג מספריים (איור 1A).</li>
		<li>השתמשו בגוזם עצמות ובמספריים כדי להפריד בין הלסתות התחתונות לראש (איור 1B-C).</li>
		<li>פתחו את חוט השדרה על-ידי החדרת גוזם עצם לתוך החלק הגבי של החוליות והסירו את החלק הגבי של החוליות כדי לחשוף את חוט השדרה ואת גזע המוח (איור 1D).</li>
		<li>חתכו את החלק הקאודאלי של הגולגולת בגבולות העצמות העורפיות והבין-פריאטליות כדי להסיר את מבני העצם האלה שחושפים את המוח הקטן (איור 1E). הערה: חשוב לא לפגוע בגזע המוח ובחוט השדרה בעת חיתוך והסרה של החוליות.</li>
		<li>יש לבודד את ה-TNC (Sp5C) הפועל באופן קאודיאלי במרחק של כ-13-16 מ"מ מהברגמה מכל צד על ידי חיתוך החלק הגבי של גזע המוח באמצעות מספריים קפיציים. היסחף את ה-TNC השמאלי והימני לתוך SIF (איור 1E-I). הערה: התיאור מתאים לחולדות בוגרות.</li>
		<li>חתכו את הראש באמצע הגולגולת כדי לחלק את הגולגולת לשניים באמצעות מסור (איור 1J-L).</li>
		<li>הסירו בזהירות את המוח מבלי לגעת בדורה מאטר המחוברת לגולגולת באמצעות מרית וחתכו את העצב הטריגמינלי במקום שבו הוא נכנס לגזע המוח (איור 1M-P).</li>
		<li>כדי לבודד את ה- TG, חתוך אותו, כולל ענפיו סביב הגבולות החזותיים. חותכים את הענף המנדיבולרי שבו הוא נכנס לאובלה של פורמן. חותכים את ענפי העיניים והמקסילריים הנכנסים לגולגולת מכיוון שהם אינם מחולקים באופן מקרוסקופי. בזמן ניתוח ה-TG, הסירו את הדורה מאטר שמכסה את ה-TG (איור 1Q-T).</li>
		<li>לטבול את חצאי הגולגולת ואת ה- TGs ב- SIF.</li>
	</ol></li>
	<li>הכן את רקמת העכבר לפי השלבים הבאים.<ol><li>הסירו את העור והשרירים סביב הראש והצוואר באמצעות מספריים קטנים (איור 2A-B).</li>
		<li>פתח את חוט השדרה על-ידי החדרת זוג מספריים קטנים לתוך החלק הגבי של החוליות והסר את החלק הגבי של החוליות כדי לחשוף את חוט השדרה ואת גזע המוח (איור 2C). הערה: חשוב לא לפגוע בחוט השדרה בעת חיתוך והסרה של החוליות.</li>
		<li>חתכו את הגולגולת בגבולות העצמות העורפיות והבין-פריאטליות כדי להסיר את מבני העצמות האלה שחושפים את המוח הקטן (איור 2D-F).</li>
		<li>לאחר מכן, חתכו את עצם הקודקוד באמצע הקשת והסירו את העצם כדי לחשוף את המוח הגס (איור 2G-I).</li>
		<li>הסירו בזהירות את המוח הקטן בעזרת מרית כדי לחשוף את גזע המוח (איור 2J).</li>
		<li>בודדו את החלק המכיל TNC בגזע המוח באמצעות מספריים קפיציים (איור 2K-N). טבול את גזע המוח עם TNC ב-SIF (איור 2O).</li>
		<li>הסירו את המוח וחתכו את העצב הטריגמינלי במקום שבו הוא נכנס לגזע המוח (איור 2P-Q).</li>
		<li>כדי לבודד את ה- TG, חתוך אותו, כולל ענפיו סביב הגבולות החזותיים. חותכים את הענף המנדיבולרי שבו הוא נכנס לאובלה של פורמן. חותכים את ענפי העיניים והמקסילריים הנכנסים לגולגולת מכיוון שהם אינם מחולקים באופן מקרוסקופי. בזמן ניתוח ה-TG, הסירו את הדורה מאטר שמכסה את ה-TG (איור 2R-S).</li>
		<li>לטבול TGs ב-SIF (איור 2T).</li>
	</ol></li>
</ol>4. כביסה
<ol><li>שטפו חצאי גולגולת, TNCs ו-TGs ב-SIF למשך 30 דקות תוך החלפת ה-SIF כל 5 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: ניתן לבצע את שלבי הכביסה תוך שמירה על הרקמה במיכלי פלסטיק עם מכסה טול כדי לאפשר החלפת SIF קלה (איור 3A-B).</li>
	<li>הכינו את רקמת החולדה לפי השלבים הבאים.<ol><li>העבר חצאי TNC למכסי צינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים עם 350 μL של SIF (איור 3C).</li>
		<li>העבר את ה-TGs למכסי צינורות מיקרוצנטריפוגה - TG אחד לכל מכסה צינור מיקרוצנטריפוגה עם 350 μL של SIF (איור 3C).</li>
		<li>הניחו את חצאי הגולגולת על פלטפורמות העשויות מחימר או מצלחת תרבית בעלת 6 בארות ומלאו את הגולגולת ב-400 מיקרו-ליטר של SIF (איור 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>הכן את רקמת העכבר לפי השלבים הבאים.<ol><li>העבירו את גזע המוח עם TNC למכסה צינור מיקרוצנטריפוגה עם 250 μL של SIF (איור 3D).</li>
		<li>העבירו את שני ה-TGs למכסה צינור מיקרוצנטריפוגה עם 250 μL של SIF (איור 3D). הערה: יש להניח שני TGs לכל מכסה צינור מיקרוצנטריפוגה בעת שימוש ברקמה מעכברים.</li>
	</ol></li>
	<li>הניחו גולגולות חולדות וכובעי צינורות מיקרוצנטריפוגה עם רקמת חולדה ועכבר באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. החלף SIF באמצעות פיפטה כל 5 דקות למשך 20 דקות. הערה: חשוב לא לגעת ברקמה בעת הוספה והסרה של SIF.</li>
</ol>5. בדיקות סמים
<ol><li>קבע את רמות השחרור הבסיסיות של CGRP.<ol><li>לאחר הכביסה האחרונה, יש להוסיף 250 μL של SIF לעכבר TG ו-TNC. הוסיפו 350 μL לחולדה TG ו-TNC ו-400 μL לכל גולגולת חולדה.</li>
		<li>לאחר 10 דקות של דגירה, אסוף 200 μL של הדגימה בצינור microcentrifuge והוסף 50 μL של 10x EIA buffer (מסופק עם ערכת האנזים CGRP immunoassay, ראה טבלת חומרים) כדי לאפשר מדידה של שחרור CGRP הבסיסי (שלב 6). יש להשליך את הנוזל הנותר. הערה: זמן הדגירה חייב להיות זהה עבור כל הדגימות.</li>
		<li>מיד, לאחסן את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לאחר דגימה של רמות שחרור CGRP בסיסיות, בצע אחת משלוש השיטות: (A) גירוי יחיד (שלב 5.2); (B) גירוי ריכוז-תגובה (שלב 5.3); ו-(C) עיכוב גירוי (שלב 5.4) (איור 4). הערה: תרכובת הבדיקה והריכוזים שבהם נעשה שימוש תלויים במטרת המחקר.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע גירוי יחיד בהתאם לשלבים הבאים.<ol><li>הוסיפו תרכובת בדיקה או רכב לרקמה והשאירו אותה למשך 10 דקות (נפח: 250 μL עבור עכבר TG ו-TNC, 350 μL עבור TG ו-TNC של חולדה, ו-400 μL עבור כל גולגולת חולדה).</li>
		<li>לאחר 10 דקות של דגירה, לאסוף 200 μL של הדגימה בצינור microcentrifuge עם 50 μL של 10x EIA חיץ. יש להשליך את הנוזל הנותר ולאחסן מיד את הדגימות בטמפרטורה של -20°C. הערה: זמן הדגירה חייב להיות זהה עבור כל הדגימות.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע גירוי תגובת ריכוז בהתאם לשלבים הבאים.<ol><li>יש לדלל את תרכובת הבדיקה או הרכב לריכוזים הרצויים. הוסף את תרכובת הבדיקה בהגדלת הריכוזים החל מהריכוז הנמוך ביותר. הערה: תרכובת הבדיקה והריכוזים שבהם נעשה שימוש תלויים במטרת המחקר. לדוגמה, 1 μM, 10 μM, ו 100 μM supercinnamaldehyde שימשו במחקר הנוכחי.</li>
		<li>הוסף את הריכוז הנמוך ביותר (1 μM עבור המחקר הנוכחי) של תרכובת הבדיקה והרכב המתאים לשני תכשירי רקמה זהים ודגרה במשך 10 דקות (נפח: 250 μL עבור רקמת עכבר, 350 μL עבור חולדה TG ו- TNC, ו 400 μL עבור כל גולגולת חולדה).</li>
		<li>לאחר 10 דקות של דגירה, לאסוף 200 μL של הדגימה בצינור microcentrifuge עם 50 μL של 10x EIA חיץ.</li>
		<li>יש להשליך את הנוזל הנותר ולהוסיף את הריכוז השני הנמוך ביותר (10 מיקרומטר למחקר הנוכחי) לרקמה.</li>
		<li>מיד, לאחסן את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>חזור על הליך זה עם הריכוזים הנותרים (100 μM עבור המחקר הנוכחי).</li>
	</ol></li>
	<li>בצע עיכוב של גירוי בעקבות השלבים הבאים.<ol><li>מוסיפים את החוסם או הרכב לרקמה ודוגרים במשך 10 דקות (נפח: 250 μL עבור רקמת עכבר, 350 μL עבור חולדה TG ו- TNC, ו- 400 μL עבור כל גולגולת חולדה). הערה: החוסם והריכוז שבהם נעשה שימוש תלויים במטרת המחקר. לדוגמה, 3 μM glibenclamide שימשו לתוצאה המייצגת באיור 5.</li>
		<li>לאחר 10 דקות של דגירה, לאסוף דגימה של 200 μL בצינור microcentrifuge עם 50 μL של 10x EIA חיץ. יש להשליך את הנוזל הנותר ולאחסן מיד את הדגימות בטמפרטורה של -20°C.</li>
		<li>מוסיפים את האגוניסט או האגוניסט + החוסם (ראו טבלת חומרים) לרקמה ודוגרים במשך 10 דקות. הערה: האגוניסט, החוסם והריכוזים שבהם נעשה שימוש תלויים במטרת המחקר. במחקר הנוכחי נעשה שימוש ב-3 מיקרומטר של גליבנקלמיד ו-1 מיקרומטר של קפסאיצין, איור 5.</li>
		<li>לאחר 10 דקות של דגירה, לאסוף דגימה של 200 μL בצינור microcentrifuge עם 50 μL של 10x EIA חיץ. יש להשליך את הנוזל הנותר ולאחסן מיד את הדגימות בטמפרטורה של -20°C.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע בקרה חיובית עבור הניסוי.<ol><li>בעת הצורך, הוסף בקרה חיובית (למשל, 1-10 μM של קפסאיצין, ראה טבלת חומרים) לרקמה בסוף הפרוטוקול ואסוף דגימה של 200 μL בצינור microcentrifuge עם 50 μL של 10x EIA buffer לאחר תקופת דגירה של 10 דקות. הערה: כדאי לכלול בקרה חיובית כדי להבטיח שההתקנה והרקמות מתפקדות. קפסאיצין 48,49,50 או הגירוי הדה-פולריזציה של אשלגן (40-60 מ"מ של KCl)46,47,49 משמשים באופן שגרתי כדי לגרום לשחרור CGRP מהמערכת הטריגמינווסקולרית. 40-60 mM של KCl SIF מוכן כמו SIF, למעט NaCl מוחלף עבור KCl על בסיס שווה.</li>
	</ol></li>
</ol>6. ניתוח ריכוזי CGRP
<ol><li>מדוד את כמות ה-CGRP המשתחררת באמצעות ערכת בדיקת אנזימים (EIA) בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>מדוד את הצפיפות האופטית ב-410 ננומטר באמצעות פוטומטר צלחת. אם נעשה שימוש בערכת CGRP EIA אחרת, מדוד את הצפיפות האופטית באורך הגל המסופק בפרוטוקול היצרן. הערה: יש לדלל את הדוגמאות כך שיתאימו לעקומה הסטנדרטית.</li>
	<li>בצע ניתוח נתונים.<ol><li>הצג את הנתונים כריכוזים מוחלטים או נרמל לשחרור CGRP הבסיסי מהרקמה הספציפית.</li>
	</ol></li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה המתוארת פותחה בעקבות מחקרים שהראו את החשיבות של CGRP בפתופיזיולוגיה של מיגרנה. הוא מתאים היטב לחקר המנגנונים המעורבים בשחרור CGRP מהמערכת הטריגמינווסקולרית, שהיא חיונית לאיתות כאב באזור הראש. כמות ה-CGRP המתקבלת במודל זה מודדת ישירות את שחרור ה-CGRP מהעצבים הטריגמינליים הפנימיים של דורה מאטר, TG ו-TNC. כמות שחרור ה-CGRP גדולה יותר מבחינה כמותיתמ-45,54 מהשחרור שנמדד בפלזמה לאחר התרמוקו-קרישה בבני אדם, גירוי טריגמינלי בחתול 39,55,56 ובמהלך התקפי מיגרנה 23. הסבר אחד יכול להיות כי CGRP הוא מדולל ומושפל בדם54. עם זאת, יש לציין כי גירוי ישיר עם כימיקלים עשוי להיות עדיף על הפעלה פתופיזיולוגית. יתרונות נוספים הם שניתן לאתר את השחרור משלושה אתרים שונים בתוך המערכת הטריגמינווסקולרית וכי ניתן להשתמש בו יחד עם מניפולציה פרמקולוגית וברקמות ממכרסמים מהונדסים גנטית.
לאחרונה, מודלים פרה-קליניים רבים של מכרסמים מתמקדים במתן סיסטמי של חומרים וקריאות הקשורות לכאב או מיגרנה לאחר מכן באמצעות בדיקת פון פריי57,58, 59,60,61 או סלידה קלה62,63,64. שיטות אלה שימושיות בהבנת התכונות של גרימת כאב ושיכוך כאבים של חומרים שונים. עם זאת, גישות אלה אינן מספקות מידע על רקמות מטרה ספציפיות המעורבות. בשיטה הנוכחית, המערכת הטריגמינובסקולרית מחולקת לשלושה מבנים: הדורה מאטר, TG ו- TNC. הדבר מאפשר חשיפה מקומית של כל מבנה והערכת מיקום הפעולה של חומר מסוים. זה נוצל במחקר משנת 2011, שבו נחקר תפקידן של תעלות סידן מגודרות מתח בחולדות, והעיכוב של תעלות אלה נמצא שונה בשלושת המבנים של המסלול הטריגמינווסקולרי47. כאשר לנתח מבנים של מערכת העצבים, אקסוטומיה היא בלתי נמנעת. אקסוטומיה הוכחה כמשנה את השעתוק של גנים שונים65. שינויי שעתוק אלה איטיים מכדי להשפיע על התוצאות משיטה זו, אך לא ניתן לשלול שינויים בזרחון בהשוואה למצבי in vivo 46. למרות נוירופפטידים כגון CGRP נוצרים בסומה התא, שחרור ופעולה של נוירופפטידים הם בדרך כלל בקצות העצבים המרכזיים או ההיקפיים. לכן, מחקרים של נוירונים שלמים, כולל מסופים, מעניינים כאשר חוקרים שחרור נוירופפטידים. לכן, שיטות של לימוד תרבויות של נוירונים מגרעינים מבודדים הוקמו כדי לשמש מודל של הטרמינלים. עם זאת, תרביות תאים עצביים חשופות למספר בעיות שכן דיסוציאציה מכנית יכולה להרוס נוירונים בתרבית46. מסגרת הזמן הארוכה יותר הקשורה להתרבות תאים משאירה שיטה זו רגישה לשינויים תעתיקיים עקב תנאי אקסוטומיה ותרבית65. יתר על כן, תוספת של גורמי גדילה והתרבות על ציפויי פני השטח שינו את התכונות העצביות כביטוי משדר וקולטן66,67,68,69. בעיות אלה נמנעות כאשר חוקרים גרעינים שלמים שבודדו זה עתה במקום תרביות תאים עצביים.
אחד האתגרים בשיטת השחרור ex vivo CGRP הוא הדיסקציה המדויקת של הרקמה הנדרשת לתוצאות הניתנות לשחזור. דיסקציה מדויקת במיוחד של TNC היא מאתגרת מכיוון שמדובר במבנה בתוך גזע המוח ללא גבולות נראים לעין. יתר על כן, הדורה מאטר שברירית, והסרת המוח צריכה להתבצע בזהירות כדי להבטיח מבנה שלם. מכשולים אלה יכולים לגרום לגודל רקמה משתנה, ולכן, רמות CGRP משתנות של הבסיס והגירוי. עם זאת, וריאציה זו יכולה להיות מוסברת על ידי נורמליזציה לשחרור CGRP הבסיסי. כמו כן יש לציין כי בעת בידוד TNC מעכברים, כל החלק התחתון של גזע המוח מבודד ולא החלק הספציפי יותר המכיל TNC כפי שנעשה בחולדות. באופן כללי, זה יכול להיות יתרון להשתמש ברקמת חולדה, שכן זה מאפשר מדידה של שחרור CGRP מדורא מאטר ודיסקציה מדויקת יותר של TNC. יתר על כן, גודל הרקמה מאפשר גם שימוש בחולדה כבקרת הרכב שלה, שכן חולדה אחת גורמת לשני חצאי גולגולת, שני TGs ושני TNCs כאשר חתיכה אחת של הרקמה משמשת לגירוי החומר והשנייה לרכב. בעת שימוש בעכברים, יש צורך בשני בעלי חיים לניסוי אחד, שכן שני ה-TGs מרוכזים בדגימה אחת, וה-TNCs מנותחים כגזע מוח אחד. לכן, שני TGs וגזע מוח אחד משמשים לגירוי חומרים, ושני TGs וגזע מוח אחד מעכבר אחר משמשים לבקרת רכב. התוצאה היא שימוש בכמות כפולה של עכברים בהשוואה לחולדות כדי לקבל את אותו מספר של שכפולים. כדי להפחית את מספר העכברים שבהם משתמשים, הוצעה שיטה למדידת שחרור CGRP מפרוסות גזע המוח49. זה יתרון כי השיטה שונתה כדי לאפשר את השימוש בעכברים. זה מאפשר שימוש בזני עכברים מהונדסים רבים שכבר זמינים, כלי שימושי ללימוד, למשל, מסלולי איתות. יש לכלול בקרה חיובית בסוף הניסוי כדי להבטיח שהרקמה ששימשה בניסוי תוכל לשחרר CGRP. הבקרה החיובית יכולה להיות קפסאיצין אגוניסט TRPV1 או אשלגן הגירוי הדפולריזציה (KCl), אשר נמצאו כמשחררים CGRP מהמערכת הטריגמינווסקולרית הן בעכברים והן בחולדות 46,47,48,49,50. יתר על כן, השיטה הותאמה גם למדידת שחרורם של פפטידים רלוונטיים אחרים כפפטיד מפעיל אדנילט ציקלאז (PACAP) - פפטיד נוסף בעל עניין רב במחקר מיגרנה70.
השיטה מספקת כלי שימושי לחקר שחרור CGRP מרקמות מטרה ספציפיות בחולדות ובעכברים. זוהי שיטה מהירה יחסית המונעת בעיות הקשורות culturing נוירונים. ניתן לשנות בקלות את פרוטוקול השיטה כדי לחקור את הקשר בין ריכוז לתגובה או עיכוב תגובה על ידי תרכובות פרמקולוגיות שונות. שיטת השחרור ex vivo CGRP היא אחת מכמה שיטות פרה-קליניות שימושיות לחקר התפקיד של CGRP ומנגנונים אחרים הקשורים לשחרור CGRP בפתופיזיולוגיה של מיגרנה.

מיגרנה היא הפרעה נוירולוגית, על פי ארגון הבריאות העולמי, מוערך להשפיע על יותר מ -1 מיליארד אנשים והוא אחד הגורמים המובילים של נכות ברחבי העולם1. לפיכך, למיגרנה יש השפעה משמעותית הן על המטופלים והן על החברה. למרות ההצלחה הקלינית האחרונה של תרופות נגד CGRP, חלק גדול מהחולים זקוקים לאפשרויות טיפול משופרות 2,3,4,5. נדרשת הבהרה של פתופיזיולוגיה של מיגרנה המובילה לטיפולים יעילים חדשניים. איתות בתוך המערכת הטריגמינווסקולרית המורכבת מקרום המוח, הגרעינים הטריגמינליים (TG) והגרעין הטריגמינלי caudalis (TNC) הוא מרכזי לפתופיזיולוגיה של מיגרנה 6,7.
37 חומצות האמינו נוירופפטיד קלציטונין הקשורות לגן (CGRP) התגלה לראשונה בתחילת שנות ה-80 של המאה ה-20, כאשר אמארה ועמיתיו הראו כי ניתן לעבד את תעתיק ה-RNA הראשוני של הגן קלציטונין כדי לתת קידוד mRNA ל-CGRP בנוסף לקלציטונין 8,9. המחקר שלאחר מכן הציע קשר לפתופיזיולוגיה של מיגרנה10. CGRP הוא נוירוטרנסמיטר עם תכונות מרחיבות כלי דם חזקות 11,12,13,14,15,16,1 7, והוא מופץ באופן נרחב במערכת העצבים המרכזית וההיקפית 13,14,18,19,20,21,22 . המעורבות של CGRP במיגרנה הודגשה עם גילוי רמות CGRP מוגברות במחזור הדם התוך-מוחי במהלך התקפי מיגרנהבבני אדם 23, וכי עירוי של CGRP גורם לכאב דמוי מיגרנה בחולים24. שנתיים לאחר מכן, פורסם מחקר הוכחת ההיתכנות הראשון של האפקטיביות של אנטגוניסט CGRP olcegepant בטיפול במיגרנה25.
CGRP מצוי בשפע במערכת הטריגמינווסקולרית כפי שהודגם ב-TG21,26, סיבי עצב תחושתיים המעוררים את הדורה מאטר27,28,29 ו-TNC30. במערכת הטריגמינווסקולרית, CGRP נמצא בתאי העצב הקטנים עד בינוניים של ה-TG, בסיבי C לא מיאלינים, ומתבטא בכמעט 50% מהאוכלוסייה העצבית של ה-TG. קולטן CGRP מתבטא בעיקר בתאי עצב גדולים יותר ונמצא בסיבי Aδ31,32. CGRP משתחרר מתאי עצב לאחר גירוי כימי או חשמלי33,34. מחקרים על מסלולים המובילים לשחרור CGRP ומיקום הפעלה זו חיוניים להבנת פתופיזיולוגיה של מיגרנה. במהלך 5 העשורים האחרונים, מחקרים פרה-קליניים תרמו לרכישת ידע נרחב על איתותים הקשורים למיגרנה ותרמו לפיתוח טיפולים חדשים35. שיטות רבות המתחשבות במעורבות וסקולרית ונוירוגנית שונו ויושמו בחקר המיגרנה. ניתן להזכיר מודלים in vivo ו- in vitro של תגובות עורקים לתרכובות ביולוגיות או טיפולים תרופתיים17,36,37, וגירוי עצבי חשמלי38,39. יתר על כן, נוירונים מופעלים ב- TNC יכולים להיות מזוהים על ידי ביטוי c-Fos 40,41,42 והקלטות אלקטרופיזיולוגיות באזור זה 43,44. שתי השיטות מודדות אותות נוסיצפטיביים המועברים למוח מהראש, למשל דורה מאטר. השימוש במודל פרה-קליני אחד בלבד אינו מציג את התמונה המלאה של פתופיזיולוגיה של מיגרנה. לכן, חשוב לשלב מודלים שונים המכסים היבטים רבים ככל האפשר של פתופיזיולוגיה מיגרנה. המשך הפיתוח של מודלים חדשים יכסה היבטים שונים של מנגנוני מיגרנה, ועם הזמן תיחשף תעלומת הפתופיזיולוגיה של המיגרנה.
כאן, פרוטוקול מפורט מוצג של שיטת שחרור CGRP, שבוצעה ex vivo ב TG מבודד ו TNC מעכברים לאחר גירוי כימי. שחרור CGRP ניתן לחקור גם בדורה מאטר מחולדות. לפיכך, בפרוטוקול הניסוי לחולדות, דורה מאטר מתוארת יחד עם TG ו- TNC. הבסיס לשיטת שחרור CGRP תואר לראשונה בשנת 1999, שם אברסברגר ועמיתיו ערכו מחקר חלוצי ומצאו כי CGRP שוחרר מדורא מאטר לאחר גירוי כימי וחשמלי של אפרנטים דוראליים בחולדות45. מאוחר יותר, גישה זו הורחבה לשחרור CGRP מה-TG46 וה-TNC47. לאחר מכן, השיטה שונתה כך שתחול על TG ו- TNC בעכברים. עד כה, שחרור CGRP מהדורה מאטר היה מאתגר בעכברים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.1000</td>
			<td>For SIF buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for plastic containers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>536617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsaicin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M2028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP kits</td>
			<td>AH Diagnostics</td>
			<td>A05482.96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Strandm&#248;llen</td>
			<td>4.6</td>
			<td>For carbogen gassing of SIF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Bone Trimmer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16109-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glibenclamide</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G7021</td>
			<td>For SIF buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine for rats</td>
			<td>Scandidact</td>
			<td>NS-802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M5921</td>
			<td>For SIF buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcenrifuge tubes + lids/caps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-5239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Hacksaw</td>
			<td>BAHCO</td>
			<td>208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2</td>
			<td>Strandm&#248;llen</td>
			<td>4.5</td>
			<td>For carbogen gassing of SIF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Glostrup pharmacy</td>
			<td>NA</td>
			<td>Magistral formula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic containers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>536455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate photometer - Infinite M200</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>NA</td>
			<td>Infinite M200 is discontinued. A Infinite 200 PRO is available at Tecan. 
			Software: SW Magellan v.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9333</td>
			<td>For SIF buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Allgaier Instruments</td>
			<td>307-156-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissor</td>
			<td>Allgaier Instruments</td>
			<td>04-520-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S6014</td>
			<td>For SIF buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For SIF buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.1000</td>
			<td>For SIF buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium gluconate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2054</td>
			<td>For SIF buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Bochem Lab Supply</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>84097</td>
			<td>For SIF buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercinnamaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S3322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tulle (fabrics)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Bought in the local fabrics store</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo release of calcitonin gene-related peptide from the trigeminovascular system in rodents

פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) התגלה לראשונה בשנות ה-80 של המאה ה-20 כגרסת שחבור מהגן קלציטונין. מאז גילויו, תפקידו בפתופיזיולוגיה של מיגרנה התבסס היטב, תחילה על ידי תכונות מרחיב כלי הדם החזקות שלו ולאחר מכן על ידי נוכחותו ותפקודו כמוליך עצבי במערכת הטריגמינווסקולרית החושית. היכולת מעוררת המיגרנה של CGRP נתנה תמיכה לתעשיית הפארמה לפתח נוגדנים חד שבטיים ואנטגוניסטים המעכבים את ההשפעה של CGRP. פרדיגמת טיפול חדשה הוכחה כיעילה בטיפול מניעתי במיגרנה. אחד הכלים השימושיים להבנה נוספת של מנגנוני מיגרנה הוא מודל ex vivo של שחרור CGRP מהמערכת הטריגמינווסקולרית. זוהי שיטה פשוטה יחסית שניתן להשתמש בה עם כלים פרמקולוגיים שונים כדי להשיג ידע כיצד להמשיך ולפתח טיפולים יעילים חדשים במיגרנה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל שחרור CGRP ואת הטכניקה לכימות ההשפעה של חומרים פרמקולוגיים על כמות CGRP המשתחררת מהמערכת הטריגמינווסקולרית במכרסמים. הליך המתאר את הגישה הניסויית מהמתת חסד למדידת רמות החלבון מסופק. הבידוד החיוני של הגנגליון הטריגמינלי והגרעין הטריגמינלי caudalis הן מעכברים והן מחולדות והכנת דורה מאטר חולדה מתוארים בפירוט. יתר על כן, מוצגות תוצאות מייצגות משני המינים (חולדות ועכברים). הטכניקה היא כלי מפתח לחקר המנגנונים המולקולריים המעורבים בפתופיזיולוגיה של מיגרנה באמצעות תרכובות פרמקולוגיות שונות ובעלי חיים מהונדסים גנטית.

טכניקה זו היא כלי לחקור את המנגנונים המולקולריים הקשורים ל-CGRP המעורבים במיגרנה. יש לו את היתרון של הערכת שחרור CGRP מרמות שונות של מערכת trigeminovascular והוא יכול להיות מיושם הן על עכברים מסוג בר וטרנסגניים וחולדות בשילוב עם תרכובות פרמקולוגיות שונות. כאן מוצגים ניסויי ריכוז-תגובה וחסימה מחולדות ותוצאות תגובת ריכוז מעכברים מסוג בר ועכברים מהונדסים.
שיטת השחרור של CGRP שימשה כדי לחקור את ההשפעה של מעכב ערוץK ATP גליבנקלמיד על שחרור CGRP מ-TG ודורה מאטר אצל נקבות חולדות אלודינליות טריגמינליות ספונטניות (STA). ראשית, הריכוז האופטימלי של קפסאיצין נמצא באמצעות תכנון מחקר תגובה-ריכוז. חשיפה לקפסאיצין גרמה לשחרור CGRP משמעותי מדורא מאטר ו-TG בהשוואה לרכב (איור 5). בדורה מאטר, השחרור המרבי של CGRP נמצא ב-1 μM של קפסאיצין, וב-TG, השחרור המרבי של CGRP נמצא ב-10 μM של קפסאיצין (איור 5A-B). בהתבסס על ניסויי תגובת הריכוז, 1 μM של קפסאיצין ו-3 μM של גליבנקלמיד שימשו לניסויים חוסמים. גליבנקלמיד לא הראה השפעה על שחרור CGRP בסיסי מדורא מאטר (P = 0.441) ו- TG (P = 0.881) כאשר נותח עם ANOVA51 חד-כיווני. גליבנקלמיד הפחית באופן משמעותי את שחרור ה-CGRP המושרה על-ידי קפסאיצין בדורה מאטר ב-40% (P = 0.031) וב-TG ב-39% (P = 0.003) בהשוואה לקפסאיצין עם הרכב כאשר נותח באמצעות ANOVA חד-כיווני (איור 5C-D)51.
בעכברים, הפרוטוקול שימש לבחינת המעורבות של תעלת היונים הפוטנציאלית של הקולטן החולף אנקירין 1 (TRPA1) במודל עכבר GTN של מיגרנה, שבו רגישות יתר הנגרמת על ידי GTN הייתה תלויה לחלוטין בערוצי TRPA1. נמצא כי אגוניסט TRPA1 supercinnamaldehyde (SCA) משחרר CGRP באופן תלוי מינון מה-TG עם 1 μM, 10 μM ו-100 μM של SCA, וכתוצאה מכך 9% (P = 0.23), 51% (P = 0.011) ו-69% (P = 0.0097) הגדילו את השחרור של CGRP בהשוואה לרכב, בהתאמה כאשר נותחו עם ANOVA דו-כיווני. שחרור זה נעדר ב-TG מעכברי Trpa1 null שבהם חשיפה ל-1 μM, 10 μM ו-100 μM של SCA הביאה ל-11% (P > 0.99), -13% (P > 0.99) ו-9% (P = 0.97) אחוז שינוי בשחרור CGRP בהשוואה לרכב, בהתאמה כאשר נותח עם ANOVA דו-כיווני. הגירוי הבא עם 10 מיקרומטר של קפסאיצין (בקרה חיובית) מראה שכל דגימות הרקמה יכולות לשחרר CGRP (איור 6)50.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig01.jpg"> איור 1: כריתה שלב אחר שלב של רקמות מחולדות. הפרטים (A-T) מופיעים בסעיף הפרוטוקול (שלב 3.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig02.jpg"> איור 2: ניתוח שלב אחר שלב של רקמה מעכברים. הפרטים (A-T) מופיעים בסעיף הפרוטוקול (שלב 3.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig03.jpg"> איור 3: שטיפה ודגירה של רקמת מכרסמים. (א-ב) רקמה מבודדת טרייה במיכלי פלסטיק עם SIF. המכלים מכוסים טול כדי לאפשר החלפה קלה של SIF. (C) רקמת חולדה - שני חצאי גולגולת עם דורה מאטר המכסים את הבטנה הפנימית של הגולגולת מונחים על צלחת תרבית 6 בארות. הגרעין הטריגמינלי הימני והשמאלי caudalis במכסי צינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים (שורה עליונה של מכסים). שני הגרעינים הטריגמינליים במכסי צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים (שורה תחתונה של מכסים). (D) רקמת עכבר - הגרעין הטריגמינלי המכיל חלק מגזע המוח במכסה צינור מיקרוצנטריפוגה נפרד (למעלה). שני גרעינים טריגמינליים של עכברים נמצאים במכסה צינור מיקרוצנטריפוגה אחד (למטה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig04.jpg"> איור 4: תכנוני מחקר לשחרור CGRP. שלושה פרוטוקולים שונים לביצוע ניסויי שחרור CGRP. יש לדלל את התרופות בנוזל אינטרסטיציאלי סינתטי (SIF). (A) גירוי יחיד. (B) גירוי ריכוז-תגובה. (C) עיכוב של גירוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig05.jpg"> איור 5: גליבנקלמיד מעכב שחרור CGRP המושרה על-ידי קפסאיצין מחולדות דורה מאטר ומגנגליון טריגמינלי. רמות CGRP מגנגליון טריגמינלי ודורה מאטר שבודדו מנקבות חולדות אלודינליות טריגמינליות ספונטניות (STA) (215-318 גרם) שמקורן במקור באוניברסיטת תומאס ג'פרסון52 נמדדו באמצעות ערכות CGRP EIA אנושיות מסחריות. (א-ב) שחרור CGRP מ-(A) דורה מאטר ו-(B) גנגליון טריגמינלי לאחר הגדלת ריכוזי קפסאיצין (10 ננומטר, 100 ננומטר, 1 מיקרומטר ו-10 מיקרומטר) (n = 4). הנתונים מוצגים כנקודות בודדות ונותחו עם ANOVA דו-כיווני. p < 0.0001 (C-D) רמות של CGRP ששוחררו מ-(C) דורה מאטר ו-(D) גנגליון טריגמינלי לאחר חשיפה של 10 דקות לרכב, 3 μM glibenclamide (glib), 1 μM קפסאיצין ו-1 μM קפסאיצין + 3 μM glib (n = 6-11). הנתונים מוצגים כנקודות בודדות וערכים ממוצעים ונותחו עם ANOVA חד כיווני. *בהשוואה לרכב. #קפסאיצין לעומת קפסאיצין + גליב. #P < 0.05, ** ו##P < 0.01, ****P < 0.0001. הניתוחים בוצעו באמצעות מבחן ההשוואה המרובה של בונפרוני. רמה משמעותית של α = 0.05 שימשה לכל הבדיקות. נתון זה שונה מכריסטנסן ואחרים. 51. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig06.jpg"> איור 6: חשיפה ל-SCA גורמת לשחרור CGRP תלוי TRPA1 מגנגליון טריגמינלי של עכברים. רמות CGRP ששוחררו מגנגליון טריגמינלי שבודד מ-WT ו-Trpa1 null (Trpa1tm1/Dpc)53 עכברים זכרים (8-10 שבועות) נמדדו עם ערכות CGRP EIA של חולדות לאחר חשיפה לסופר-סינמאלדהיד (SCA) ב-1 מיקרומטר, 10 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר וקפסאיצין ב-10 מיקרומטר כבקרה חיובית (n = 6). הנתונים מכל עכבר מוצגים כנקודות נפרדות, ופסים מציינים את הערכים הממוצעים. סטטיסטיקה: ההשוואה בין SCA לרכב בכל ריכוז ובין בקרה בסיסית לחיובית בוצעה עם ANOVA דו-כיווני חוזר. רמה משמעותית של α = 0.05. *P < 0.05, **P < 0.01. נתון זה שונה מכריסטנסן ואחרים. 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents at JoVE.com

Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את מודל שחרור הפפטיד הקשור לגן ex vivo calcitonin (CGRP) ואת האסטרטגיה לכמת את ההשפעה של חומרים פרמקולוגיים על כמות CGRP המשתחררת מהמערכת הטריגמינווסקולרית במכרסמים.

אקס ויוו שחרור פפטיד הקשור לגן קלציטונין ממערכת Trigeminovascular במכרסמים

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) was first discovered in the 1980s as a splice variant from the calcitonin gene. Since its discovery, its role in ...

שיטה זו היא כלי לחקור מנגנונים המעורבים בשחרור CGRP ממערכת כלי הדם הטריגמינלית. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לחלק את מערכת כלי הדם הטריגמינליים לשלושה אתרים שונים ולהעריך את שחרור ה- CGRP בתוך כל אתר נפרד. מי שמדגימים את ההליך יהיו אני ואינגר יאנסן-אולסן, מדענית בכירה מהקבוצה שלנו.כדי להתחיל, להכין את רקמת החולדה על ידי הסרת העור ואת השריר סביב הראש והצוואר באמצעות מספריים. לאחר מכן, השתמש גוזם עצם וזוג מספריים כדי להפריד את הלסתות התחתונות מהראש. כעת חשוף את חוט השדרה ואת גזע המוח על ידי החדרת גוזם עצם לתוך החלק הגבי של החוליות והסר אותו.לאחר מכן לחתוך את החלק caudal של הגולגולת על ידי גבולות של עצמות occipital ו interparietal כדי להסיר את מבני העצם האלה, חושף את המוח הקטן. כדי לבודד את ה-TNC הפועל כ-13 עד 16 מילימטרים מהברגמה מכל צד, חתכו את החלק הגבי של גזע המוח במספריים קפיציים. לאחר מכן טבילת TNC בצד שמאל וימין לתוך SIF.לאחר מכן, חותכים את הראש באמצע כדי לחלק את הגולגולת לשניים באמצעות מסור. עכשיו להסיר בזהירות את המוח מבלי לגעת dura mater מחובר הגולגולת באמצעות מרית. כדי לבודד את ה- TG, חותכים אותו כולל ענפיו סביב גבולות הראייה כאשר הענף המנדיבולרי נכנס לפורמן אובלה והענפים האופטלמיים והמקסילריים נכנסים לגולגולת.לאחר מכן לטבול את חצאי הגולגולת ואת TGs ב- SIF. כדי להכין את רקמת העכבר, הסר את העור ואת השריר סביב הראש והצוואר באמצעות מספריים. כעת חשוף את חוט השדרה ואת גזע המוח על ידי החדרת זוג מספריים באופן קאודלי לחלק הגבי של החוליות והסר אותו.לאחר מכן לחתוך את החלק caudal של הגולגולת על ידי גבולות של עצמות occipital ו interparietal כדי להסיר את מבני העצם האלה חושפים את המוח הקטן. חותכים את עצם הקודקוד באמצע ומסירים את העצם כדי לחשוף את המוח. בזהירות להסיר את המוח הקטן כדי לחשוף את גזע המוח באמצעות מרית.יש לבודד את ה-TNC המכיל חלק מגזע המוח באמצעות מספריים קפיציים, ולאחר מכן לטבול את גזע המוח לתוך SIF. עכשיו בזהירות להסיר את המוח באמצעות מרית לחתוך את העצב trigeminal שבו הוא נכנס לגזע המוח. כדי לבודד את ה- TG, חותכים אותו כולל ענפיו סביב גבולות הראייה עם הענף המנדיבולרי שבו הוא נכנס לענפים האופטלמיים והמקסילריים הנכנסים לגולגולת.לאחר מכן, לטבול TGs ב- SIF. להחלפה קלה של SIF, הוסיפו מכסה אגרה למיכלי הפלסטיק והתחילו לשטוף את רקמת החולדה והעכבר ב-SIF למשך 30 דקות על ידי החלפת SIF כל חמש דקות. לאחר 30 דקות של שטיפה בטמפרטורת החדר, העבירו חצאי TNC של חולדות ו-TGs של חולדות כדי להפריד בין מכסי צינורות מיקרוצנטריפוגה עם 350 מיקרוליטרים של SIF.העבר את גזע המוח של העכבר עם TNC למכסה צינור מיקרוצנטריפוגה עם 250 מיקרוליטר של SIF. לבסוף, העבר את שני ה- TGs של העכבר למכסה צינור מיקרוצנטריפוגה עם 250 מיקרוליטר של SIF. מניחים את חצאי גולגולת החולדה על צלחת תרבית בת שש בארות וממלאים את הגולגולת ב-400 מיקרוליטרים של SIF.הניחו גולגולות חולדות בכובעי צינורות מיקרוצנטריפוגה עם רקמת חולדה ועכבר באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יש להחליף את ה-SIF באמצעות פיפטה כל חמש דקות למשך 20 דקות מבלי לגעת ברקמה. הכן צינורות microcentrifuge לאיסוף דגימות על ידי תיוג מתאים.לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטרים של 10 חוזק EIA חיץ לכל צינור microcentrifuge. לאחר מכן, הכינו את תמיסת תרכובת הבדיקה ותמיסת הרכב על ידי דילול ב-SIF לכל הריכוזים. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של SIF לעכבר TG ו-TNC, 350 מיקרוליטרים SIF לחולדות TG ו-TNC, ו-400 מיקרוליטרים SIF לכל גולגולת חולדה.לאחר 10 דקות של דגירה, אסוף 200 מיקרוליטרים של הדגימה בצינור מיקרוצנטריפוגה מסומן מראש עם 50 מיקרוליטרים של 10 חוזק EIA כדי לאפשר מדידה של שחרור CGRP הבסיסי. יש להשליך את הנוזל הנותר ולאחסן מיד את הדגימות בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס. מוסיפים את תרכובת הבדיקה ברכב המתאים בריכוזים הולכים וגדלים, החל מהריכוז הנמוך ביותר, ודוגרים במשך 10 דקות.לאחר 10 דקות של דגירה, לאסוף 200 microliters של הדגימה בצינור microcentrifuge מסומן מראש עם 50 microliters של 10 חוזק EIA חיץ. יש להשליך את הנוזל הנותר ולהוסיף את הריכוז השני הנמוך ביותר לרקמה. מיד לאחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס ולחזור על הליך זה עם הריכוז הנותר.כדי לבצע בקרה חיובית לניסוי, הוסף את הבקרה החיובית לרקמה בסוף הפרוטוקול. לאחר תקופת דגירה של 10 דקות, לאסוף דגימה של 200 מיקרוליטר בצינור microcentrifuge עם 50 microliters של 10 חוזק EIA חיץ. ריכוזי ה-CGRP המשתחררים בדגימות שנאספו נמדדים באמצעות ערכת EIA תוך ביצוע הוראות היצרן המצורפות לערכת EIA.בחולדה, חשיפה לקפסאיצין גרמה לשחרור CGRP משמעותי מדורא מאטר ו-TG בהשוואה לרכב. בדורה מאטר, השחרור המרבי של CGRP נמצא במיקרומולר אחד של קפסאיצין. וב-TG, שחרור ה-CGRP המרבי נמצא ב-10 מיקרומולר של קפסאיצין.כאשר מנתחים אותו עם ANOVA חד-כיווני, glibenclamide לא מראה השפעה על שחרור CGRP בסיסי מדורא מאטר ו-TG. גליבנקלמיד הפחית באופן משמעותי את שחרור ה-CGRP המושרה על-ידי קפסאיצין בדורה מאטר ב-40% וב-TG ב-39% בהשוואה לקפסאיצין עם הרכב כאשר ניתח אותו עם ANOVA חד-כיווני. פוטנציאל הקולטן החולף Ankyrin-1 אגוניסט סופר cinnamaldehyde נמצא לשחרר CGRP באופן תלוי ריכוז מן TG עם 1, 10, ו 100 micromolar של סופר cinnamaldehyde וכתוצאה מכך 9%52% ו 69% שחרור מוגבר של CGRP בהשוואה לרכב בהתאמה כאשר נותח עם ANOVA דו כיווני. השחרור המוגבר של CGRP נעדר ב-TG מפוטנציאל הקולטן הארעי Ankyrin-1 בעכברי נוקאאוט שבהם חשיפה ל-1, 10 ו-100 מיקרומולאר של סופר סינמלדהיד וכתוצאה מכך 11%מינוס 13% ו-9% שינוי בשחרור CGRP בהשוואה לרכב בהתאמה כאשר ניתחו אותו עם ANOVA דו-כיווני.חשוב להיזהר שלא לגעת ברקמה במהלך איסוף הדגימה ולדייק בעת תזמון זמן הדגירה של כל הדגימות. אם קיימות ערכות ELISA מתאימות, ניתן ליישם הליך זה כדי למדוד את שחרורם של פפטידים אחרים הנמצאים במערכת כלי הדם הטריגמינלית.

אקס ויוו שחרור פפטיד הקשור לגן קלציטונין ממערכת Trigeminovascular במכרסמים

Abstract