Yazarlar, çalışma ekibine teşekkür etmek ve özellikle PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte'deki biyoaraştırma ve aerosol ekiplerinin teknik yardım ve desteğini kabul etmek istiyor. Ltd., Singapur ve PMI AR-GE, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, İsviçre. Yazarlar, biyobankacılığı yönettiği için Sam Ansari'ye teşekkür eder ve Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy'nin el yazmasının taslağını düzenlediği için desteğini kabul eder.

Tüm yazarlar Philip Morris International'ın çalışanlarıdır. Philip Morris International, bu projenin tek finansman kaynağı ve sponsorudur.

Sigara dumanı (CS), pulmoner karsinom, bronşit ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) dahil olmak üzere akciğerin kronik enflamatuar hastalıklarının gelişimi ile ilişkili ana risk faktörü olarak kabul edilmektedir1. Akciğer etkisinin ötesinde, CS maruziyeti aterosklerotik koroner arter hastalığı ve periferik vasküler hastalık1 gibi diğer hastalıkların gelişiminde önemli bir rol oynar. Kardiyovasküler hastalıklar, KOAH ile birlikte, dünya çapında sırasıyla birinci ve üçüncü önde gelen ölüm nedenleridir. Toksikolojik risk değerlendirme yaklaşımları tarihsel olarak kemirgenler gibi hayvan modellerinin kullanımına dayanmıştır. İn vivo sadece burun veya tam vücut sıçan ve fare modelleri, CS'ye maruz kalmanın uzun vadeli etkilerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Örneğin, genel olarak, 6 aylık dumana maruz kalma, murin akciğerlerinde, amfizem, hava yolu yeniden şekillenmesi ve pulmoner hipertansiyon dahil olmak üzere insan hastalığınınkini taklit eden histolojik ve fonksiyonel anormalliklere neden olur, ancak değişiklikler uzun süreli insan sigara içenlerde gözlenenlere kıyasla nispeten hafiftir2. Hem hayvan hem de insan dokularında, çalışmalar oksidatif stres yanıtları, inflamasyon ve yapısal doku değişiklikleri de dahil olmak üzere CS maruziyetine yanıt olarak çok çeşitli moleküler değişiklikler gözlemlemiştir 3,4. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, CS maruziyetinin, sürfaktan lipitler, lipit sinyal aracıları ve yapısal lipitler üzerindeki etkiler de dahil olmak üzere akciğer lipidome üzerinde geniş kapsamlı bir etkiye sahip olduğu bildirilmiştir 4,5,6.
Fare akciğerlerinin uzun süreli CS maruziyetinin neden olduğu toplu lipit değişikliklerini karakterize etmek için, hızlı ve kantitatif bir av tüfeği doğrudan infüzyon kütle spektrometresi analizi gerçekleştirdik. Av tüfeği lipidomik yönteminin 2005yılında tanıtılmasından sonra 7, bu yöntem lipid hücresel metabolizması hakkındaki bilgimizi genişletmek için etkili bir şekilde kullanılmıştır 8,9,10 maya 11, Caenorhabditis elegans12 ve Drosophila melanogaster13 gibi model sistemlerde ve ayrıca hücre hatları 14 gibi çok çeşitli memeli örnek tiplerinde, 15,16 çeşitli insan17,18 ve kemirgen dokuları19,20 ve vücut sıvıları21,22.
Son yıllarda, çalışmalar birbirine bağlı binlerce protein, lipit ve metabolit içeren çevresel değişikliklere hücresel tepkilerin karmaşıklığını ortaya koymuştur. Bu, moleküler makinelerin derinlemesine bir görünümünü elde etmek ve eksojen fizyolojik etkilerin tam büyüklüğünü ortaya çıkarmak için en son analitik teknikleri kullanmanın gerekli olduğunu açıkça ortaya koymuştur. Bu bağlamda, av tüfeği lipidomik yaklaşımları ile üretilen kapsamlı, kantitatif lipid parmak izleri, lipid hücresel metabolizması 8,9,10 hakkındaki bilgilerimize etkili bir şekilde katkıda bulunabilir.
CS maruziyetini çeşitli hastalıklar için bir risk faktörü olarak ele alan toksikolojik risk değerlendirme yaklaşımları tarihsel olarak kemirgenler gibi hayvan modellerinin kullanımına dayanmıştır. Av tüfeği lipidomics MS, çok sayıda numune tipinde lipidom pertürbasyonunu değerlendirmek için hızlı, hassas ve kantitatif bir analitik araç sağlar. Av tüfeği lipidomiklerinin benzersiz özelliği, bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) nanospray23 üreten iletken bir nanoçip kullanarak, yüksek çözünürlüklü bir MS cihazına kromatografik ayırma olmadan, etiketli iç standartlarla çivilenmiş toplam lipit ekstraktının otomatik doğrudan enjeksiyon analizidir.
MS1 modunda eşzamanlı olarak elde edilen kütle-yük oranı bilgisi, tüm bozulmamış endojen lipitlerin toplam lipit ayak izini sağlar. İsteğe bağlı olarak, ana lipit moleküllerinin parçalandığı ve analiz edildiği MS2/MS3 modu, ek yapısal bilgiler sağlar. Veri analizi, özel bir yazılım gerektirir ve lipit tanımlamasına ve varsayılan kimyasal yapı aydınlatmasına yol açan havuzlanmış spektrumlardaki spektrumların ve tepe atamalarının dekonvolüsyonunu içerir. Ek olarak, mutlak niceleme, ilgilenilen lipit sınıfı başına en az bir lipit standardı içeren etiketli bir iç standart karışımının yükseltilmesiyle gerçekleştirilebilir. Genel olarak, mevcut teknikle, numune başına birkaç dakika süren MS analizi, kemirgen dokularında 14 lipit sınıfı24'ten 800'e kadar lipitin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini kapsayabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 5, and 2 mL self-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086, 30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm stainless still beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 &#181;m nozzle chip</td>
			<td>Advion</td>
			<td>HD-D-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45754-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;23209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33065-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650498-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34856-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34873-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse pooled plasma</td>
			<td>BioIvt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SPLASH standard</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330710X</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-flat bottom well transparent plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62409-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z560049-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum diluent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td>
			<td>Covaris</td>
<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Magnetic hammer</td>
			
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChipSoft 8.3</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidXplorer 1.2.8.1</td>
			<td>N/A</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to identify lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak By Peak</td>
			<td>SpectroSwiss</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>ProteoWizard</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive MS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>High resolution orbitrap mass spectrometer</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
<td>.&#160; &#160;</td>		
	<td>Tissue lyser</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD140DDA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M nano plus</td>
			<td>Tecan</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Plate reader</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriVersa Nanomate</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Direct infusion nano-source</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur 4.3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun lipidomics of rodent tissues

Lipitler, tüm prokaryotik ve ökaryotik hücrelerin temel bileşenleri olarak hayati bir rol oynamaktadır. Kütle spektrometrisindeki sürekli teknolojik gelişmeler, lipidomikleri homeostatik ve hastalık durumlarında doku lipidom bileşimlerini izlemek için güçlü bir analitik araç haline getirmiştir. Bu yazıda, farklı doku ve biyoakışkan numunelerindeki birkaç yüz moleküler lipit türünün yüksek verimde eşzamanlı tespitini ve nicelleştirilmesini destekleyen bir av tüfeği lipit analiz yöntemi için adım adım bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, kromatografik ayırma olmadan etiketli iç standartlarla çivilenmiş toplam lipit ekstraktının otomatik nano-akışlı doğrudan enjeksiyonunu yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometri cihazına enjekte eder. Kemirgen dokusunun mikrogram altı miktarlarından başlayarak, MS analizi numune başına 10 dakika sürer ve fare akciğer dokusundaki 14 lipit sınıfından 400'e kadar lipiti kapsar. Burada sunulan yöntem, hastalık mekanizmalarını incelemek ve kemirgen dokularında erken toksisiteyi veya faydalı etkileri gösteren biyobelirteçleri tanımlamak ve ölçmek için çok uygundur.

Burada, temsili sonuçlar olarak, CS'nin farelerin akciğerleri üzerindeki etkilerini incelemek için av tüfeği lipidomiklerinin nasıl kullanılabileceğini gösteren veriler sunuyoruz. Av tüfeği lipid analizi protokolü, iki grup numunenin karşılaştırmalı analizi için in vivo bir çalışma için başarıyla uygulanmıştır: CS'ye maruz kalan dokuz dişi Apoe-/- fareden diseke edilen akciğer dokuları (3R4F grubu; pozitif kontrol) ve temiz hava koşullarında tutulan eşit sayıda fare (sahte grup) 3 ayda toplanan negatif kontrol olarak, 4 ay ve 6 ay maruz kalma zaman noktaları. Hayvanlar 22 °C ± 2 °C sıcaklıkta ve %55 ± %15 nemde filtrelenmiş ve şartlandırılmış temiz hava altında tutuldu ve gama ışınlı pelet diyeti ile beslendi. Işık rejimi günde 12 saatte tutuldu. Her kafes başına sekiz adede kadar fare yerleştirildi. Phillips ve ark.27'ye göre, 28 μg nikotin / L'ye eşdeğer bir hedef maruz kalma konsantrasyonu için 3R4F CS aerosolünü (600 μg toplam partikül madde TPM / L aerosolü) üretmek üzere Kentucky Üniversitesi'nden maruz kalma tedavisi için 3R4F referans sigaraları satın alındı .CS 3R4F sigaralarından elde edilen duman, 30 portlu döner sigara makineleri kullanılarak üretildi.27 . Health Canada Yoğun Sigara İçme Protokolü'ne dayanarak, yeterli maruziyeti sağlamak için 3R4F sigaralara 55 mL puf hacmi, 30 saniyede bir puf ve havalandırma deliklerinin% 100 tıkanması uygulanmıştır. Çalışma tasarımı ile ilgili tüm ek detaylar daha önce27,28 olarak bildirilmiştir.
Genel olarak, en bol bulunan 14 lipit sınıfından ~ 400 moleküler lipit türü tanımlanmış ve nicelleştirilmiştir (Şekil 3). Sınıf başına toplam normalleştirilmiş lipid konsantrasyonu PE, PEO, PC, PCO, PI ve PG lipid sınıfları için biraz yükselmiş ve SM, LPE ve PA lipitleri için bazı downregülasyon gözlenmiştir (Şekil 3A), TAG'ler ve PS için hiçbir fark görülmemiştir. . Plazmalojen lipitlerin hücre içi fonksiyonlarından biri antioksidan aktivitedir. Reaktif oksijen (ROS) ve azot türlerine (RNS) maruz kalma durumunda, diasil fosfolipitlere kıyasla plazmalojenlerin seçici oksidasyonu bildirilmiştir30. Plazmalojenlerin kimyasal yapısındaki enil-eter bağı, oksidatif strese karşı radikal saldırılara duyarlıdır31. Radikal saldırının başlıca ürünleri hidroksillenmiş eikosatetraenoik asitler, 2-monoasilgliserol fosfolipitler, pentadekanol, formik asitler, çeşitli zincir uzunluklarında α-hidroksiyaldehitler, 1-formil-2-arakidonoyl gliserofosfolipid ve lizofosfolipidlerdir.
Bu sonuçlar, toplam moleküler formüle dayanan moleküler özellikler arasında, 100-120 bileşiğin CS maruziyetinden önemli ölçüde etkilendiğini göstermektedir (Şekil 3D). MS2 parçalanma bilgisinin ayrıntılı dekonvolüsyonu ve fragman sinyal yoğunluklarının normalleştirilmesi, her lipit sınıfında temsil edilen her bir konjuge yağ asidinin (FA) toplam miktarının yaklaşık olarak tanımlanmasına (Şekil 3E) ve bu verilerin maruz kalan ve kontrol grupları arasında karşılaştırılmasına izin verdi. Hem tamamen doymuş FA'larda hem de çoğunlukla lizo-lipitler bağlamında sadece birkaç doymamış FA'da belirgin bir azalma gözlenmiştir. Buna karşılık, PC, PE ve PG fosfolipid sınıflarının bileşimindeki çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA), CS grubunda tüm zaman noktaları için yükselmiştir. Eikosapentanoik (EPA) ve dokosaheksaenoik asit (DHA) ile konjuge edilmiş aşırı PC ve PG vakaları sadece 3R4F CS maruziyet grubunda tespit edildi (Şekil 3E, kırmızı renk).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> Şekil 1: Bradford testinde numune dağılımı için plaka düzeni. Boş ve standart numuneler 1-3 numaralı sütunlarda üçlü olarak yerleştirilir; Bilinmeyen örnekler 4-11 numaralı sütunlarda çoğaltılarak yerleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> Şekil 2: Av tüfeği kütle spektrometrisi analizi için 96 delikli mikrotitre plakasının plaka düzeni. Pozitif iyonizasyon modunda elde edilmek üzere boş, standart, bilinmeyen ve QC numunelerinin dağılımı plakanın sol tarafında haritalanır (sütun 1-6); Negatif iyonizasyon modu için tüm numuneler sağa yerleştirilir (sütun 7-12). Kısaltmalar: pos = pozitif; QC = kalite kontrol; neg = negatif; TB = toplam boş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> Şekil 3: Sigara dumanına maruz kalan fare akciğerlerinin av tüfeği lipidomik analizi. Apoe − / - fareler 3R4F referans sigara veya temiz havadan (sahte) CS'ye maruz bırakıldı. (A) Lipid sınıfı konsantrasyonları ve sınıf başına düşen lipit türlerinin sayısı. Her sınıf için, nicelleştirilmiş lipit türlerinin sayısı parantez içinde verilmiştir. Her lipit sınıfı için ortalama ve% 95 güven aralıkları, her maruz kalma türü için ayrı ayrı (üç zaman noktasında toplanır). (B) 3R4F CS için nicelleştirilmiş lipit türlerinin etki boyutunu (log2 kat değişimi) ve önemini (-log10 FDR-düzeltilmiş p değeri) gösteren volkan grafikleri, üç zaman noktasında sahte karşılaştırmaya karşı. Önemli ölçüde yükselmiş lipitler sarı renkle işaretlenir; önemli ölçüde azalmış lipitler camgöbeği ile işaretlenmiştir (FDR ayarlı p değeri < 0.05). (C) En büyük mutlak ortalama kıvrım değişimine sahip 25 lipit türünün diferansiyel bolluğu. 3R4F CS ve sahte karşılaştırma için Log2 kat değişiklikleri renk kodludur ve istatistiksel anlamlılık belirtilir: *: FDR ayarlı p değeri < 0,01; X: FDR ayarlı p değeri 0,05 <. (D) Karşılaştırma grafikleri. Katlama değişimi karşılaştırmaları için korelasyon katsayıları renk kodludur ve paylaşılan diferansiyel olarak bol lipitlerin sayısı belirtilir (kenar boşluklarındaki toplam sayılar). Pasta grafikler, aynı değişim yönüne (FC işareti) sahip paylaşılan farklı şekilde bol lipitlerin yüzdesini gösterir. Yıldız işareti, farklı şekilde bol miktarda bulunan lipitlerin önemli bir örtüşmesini gösterir. (E) Lipid sınıfı başına konjuge FA'ların diferansiyel bolluğu. Her üç zaman noktasında da 3R4F ve sahte maruziyet arasında önemli bolluk farklılıkları olan konjuge yağ asitleri için panel C'deki gibi ısı haritası (FDR ayarlı p değeri < 0.05). Lipid sınıfı başına her yağ asidinin miktarı, yağ asidi fragmanlarının MS2 yoğunluklarına dayanarak tahmin edildi. Kısaltmalar: CS = sigara dumanı; FDR = yanlış keşif oranı; FC = kat değişimi; FA = yağ asitleri; PC = fosfatidilkolin; PS = fosfatidilserin; TAG = triasilgliserol; SM = sfingomiyelin; PEO = plazmalojen fosfatidiletanolamin; PE = fosfatidiletanolamin; PG = fosfatidil gliserol; PI = fosfatidilinositol; DAG = diasilgliserol; SE = sterol / kolesteril esterler; PCO = plazmalojen fosfatidilkolin; LPC = lizo fosfatidilkolin; LPE = liso fosfatidiletanolamin; PA = fosfatidik asit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>BSA nihai konsantrasyonu (mg/mL)</td>
			<td>2 mg/mL'de (μL) BSA çözeltisi</td>
			<td>Amonyum bikarbonat tamponu (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 0.125 mg/mL çözelti</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Bradford testi için kalibrasyon eğrisi için BSA iç standardının seyreltme şeması. Kısaltma: BSA = sığır serum albümini.
Ek Bilgiler: LipidXplorer lipid tanımlaması için kullanılan MFQL dosyaları. .zip paketi, her biri şu kalıbı izleyerek adlandırılan, gerekli MFQL dosyalarından oluşur: <lipid sınıfı kısaltması>_<iyonizasyon modu>_MS2.mfql (örneğin, PE_neg_MS2.mfql). Etiketli dahili standart tanımlama için dosya adları, <lipid kısaltması> ndaki D7(D9) etiketini içerir (örneğin, PED7_neg_MS2.mfql). Bu MFQL dosyaları, dahili standarttaki döteryum miktarını doğrulamak için kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Av tüfeği kütle spektrometrisine dayalı lipidomikler, çeşitli kemirgen dokularından tek bir ölçümde aynı anda geniş bir lipit sınıfları spektrumunun hassas bir kantitatif görüntüsünü sunar.

Kemirgen Dokularının Av Tüfeği Lipidomikleri

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

Sunulan protokol, hayvan dokusunda geniş bir lipit aralığının ölçülmesine izin verir. Lipit mekanizmalarını incelemek ve ayrıca hayvan modellerinde erken toksisiteyi gösteren biyobelirteçleri tanımlamak için kolay bir araçtır. Bu yöntem, numune başına 10 dakikalık bir trend süresiyle çok çeşitli numune matrislerinde 14 farklı lipit sınıfında 400'den fazla moleküler lipitin kantitatif bir profilini sunar.Başlamak için, santrifüj aliquot 1 süpernatantını amonyum bikarbonat tamponu ile konsantrasyonun iki katı kadar seyreltin. Sığır serum albümin standart eğrisini hazırladıktan sonra, standart tüpleri vorteks edin ve tüpleri oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 18.200 g'da santrifüj edin. Daha önce hazırlanan standart tüplerden, boş, standartlar ve numunelerin her biri 6 mikrolitreyi 96 delikli düz tabanlı bir plakaya aktarın.Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak her bir kuyucuğa 250 mikrolitre Bradford reaktifi ekleyin ve karıştırın. 5 dakika inkübe ettikten sonra, bir plaka okuyucu kullanarak absorbansı 595 nanometre dalga boyunda ölçün. Toplam boş ve iç standart boşluğun her bir tüpüne 100 mikrolitre amonyum bikarbonat çözeltisi ile 2 mililitrelik tüpler hazırlayın ve tüm numuneleri buz üzerinde tutun.Kalite kontrol numuneleri hazırlanır, bir kalite kontrol numunesi göz önünde bulundurularak her 10 numune seti arasına yerleştirilir. 2 mililitrelik tüplere 10 mikrolitre havuzlanmış insan plazması ekleyin, ardından tüm dahili standart boşluklara, kalite kontrol ve çalışma örneklerine 10 mikrolitre dahili standart çözelti yerleştirin. Her numuneye 300 mikrolitre eksi 20 santigrat derece bütanol metanol karışımı ekleyin ve termomikserde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 g'da çalkalayın.Daha sonra, 300 mikrolitre heptan etil asetat karışımı ekleyin ve termomikserde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 g'da çalkalayın, daha sonra 300 mikrolitre% 1 münzetik asit karışımı ekleyin ve termomikserde oda sıcaklığında 450 g'da 5 dakika çalkalayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.800 g'da santrifüj yapın ve üst fazın 360 mikrolitresini 2 olarak etiketlenmiş yeni bir 2 mililitrelik kendinden kilitli tüpe aktarın. 1 olarak etiketlenmiş su fazı tüpüne 320 mikrolitre heptan etil asetat ekledikten sonra, termomikser üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 g'da çalkalayın, daha sonra daha önce gösterildiği gibi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.800 g'da santrifüj yapın.Üst fazın 320 mikrolitresini aktarın ve bunları tüp 2'deki önceki adımdaki fraksiyonla birleştirin. Benzer şekilde, tüp 1'deki su fazına 250 mikrolitre heptan etil asetat ekleyin ve termomikserde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 g'da çalkalayın. Yine, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.800 g'da santrifüj, daha sonra üst fazın 200 mikrolitresini aktarın ve tüp 2'deki önceki adımlardan fraksiyonlarla birleştirin.Bir vakum yoğunlaştırıcıda 35 santigrat derecede kuruluğa buharlaşır ve 300 mikrolitre MS karışım çözeltisinde yeniden çözünür. Her şeyin çözünmesini sağlamak için her tüpü 5 saniye boyunca vorteks edin ve 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca 18.200 g'da santrifüjleyin. Pozitif iyonizasyon modu analizi için mikrolitre plakasına 50 mikrolitrelik bir aliquot aktarın ve 50 mikrolitre MS karışım çözeltisi ile seyreltin.Yine, 80 mikrolitre MS karışımı ile seyreltin ve negatif iyonizasyon modu analizi için MTP plakasına 20 mikrolitrelik bir aliquot aktarın. Plakayı folyo ile sarın ve analizden önce 4 santigrat derecede tutun. Bir MS'i, analizden 5 gün veya daha kısa bir süre önce üreticinin talimatlarına uygun olarak hem pozitif hem de negatif modlarda kalibre edin.Doğrudan infüzyon nano kaynağını önceden takın, MS'in transfer kılcal damarına ve çip tutucuya 4.1 mikrometrelik bir nozul çipine karşı düzgün bir şekilde hizalandığından emin olun, ardından 1.25 psi'lik bir gaz basıncına, 1.1 kilovoltluk kaynak voltajına, 5 mikrolitre numune enjeksiyon hacmine karşılık gelen pozitif ve negatif infüzyon parametrelerini kontrol edin, 2,5 saniye boyunca Rel1 çıkış kontağı kapatma, 5 dakika teslimat süresi, 4 santigrat derecede plaka soğutma, ardından sıcaklık kontrol cihazını kurun ve yeni bir plaka oluşturun. Pozitif mod için, MS yönteminin 250 santigrat derece kılcal sıcaklık ve 65.0'da S Lens RF seviyesi ile ayarlandığını kontrol edin ve ayarlayın. Xcalibur yazılımında, pozitif yöntemi açın ve tam tarama MS alımının, 1 milyonluk otomatik kazanç kontrolü ve 50 milisaniyelik maksimum enjeksiyon süresi ile 140.000 çözünürlükte 550 ila 1.000 m / z aralığında sıfırdan 1 dakikaya kadar ayarlandığını kontrol edin.680.48022 kilit kütlesini uygulayın. Veriden bağımsız MS/MS alma yönteminin, 17.500 çözünürlükte 1 ila 5 dakikalık zaman aralığı arasında, 250 m/z'lik sabit bir ilk kütle ile ayarlandığını kontrol edin. MS2 için otomatik kazanç kontrolünün 100.000'de ve maksimum enjeksiyon süresinin 64 milisaniyede ayarlandığını, çarpışma enerjisinin 20 NCE'de, yalıtım penceresinin 1 m/z'de ayarlandığını ve 398'den 1.1.100 m/z'ye kadar bir dahil etme kütle listesinin 1 Dalton'luk bir kütle adımıyla kullanıldığını kontrol edin.Negatif modda elde etmek için, MS yönteminin, MS ayar dosyasında 65.0'daki S-lens RF seviyesinde 250 santigrat derecede kılcal sıcaklık ile ayarlandığını ayar yazılımında kontrol edin. Daha sonra, Xcalibur yazılımında, tam tarama alma modunun 400 ila 940 m / z aralığını kapsayan 140.000 çözünürlükte sıfırdan 1 dakikaya, 1 milyonluk otomatik kazanç kontrolüne, maksimum 200 milisaniyelik enjeksiyon süresine ve 526.46262 kilit kütlesine ayarlandığını kontrol edin. DIA modunda MS2 alımının, 150 m/z'lik sabit bir ilk kütle, 100.000, 64 milisaniyelik maksimum enjeksiyon süresi ve 35 NCE çarpışma enerjisinin otomatik kazanç kontrolü ile 17.500 çözünürlükte 1 ila 5 dakikalık bir çözünürlükte 1 Dalton'luk bir kütle adımıyla 400'den 940'a kadar olan dahil etme kütle listesini kullanarak 1 ila 5 dakika arasında ayarlandığını kontrol edin.Xcalibur yazılımında analiz sırası kuyruğunu pozitif modda oluşturun ve tetikleyin, ardından ChipSoft yazılımında diziyi oluşturun ve numune alımının her numune için doğrudan infüzyon robotundan gelen bir kontak kapatma sinyali ile tetiklenmesini beklerken analizi başlatın. Pozitif mod analizi tamamlandığında, Xcalibur yazılımında analiz sırası kuyruğunu negatif modda oluşturun ve tetikleyin, ardından ChipSoft yazılımında diziyi oluşturun ve numune alımının her numune için doğrudan infüzyon robotundan gelen bir kontak kapatma sinyali ile tetiklenmesini beklerken analizi başlatın. Toplam normalize lipid konsantrasyonu, PE, PEO, PC, PCO, PI ve PG lipid sınıfları için hafifçe yükselmiş olan en bol 14 lipit sınıfından tanımlanmış ve ölçülmüş ve SM, LPE ve PA lipitleri için bazı aşağı regülasyon gözlenmiştir.TAG'ler ve PS için hiçbir fark görülemezken. Bu sonuçlar ayrıca, toplam moleküler formüle dayanan moleküler özellikler arasında, 100 ila 120 bileşiğin sigara dumanına maruz kalmaktan önemli ölçüde etkilendiğini göstermektedir. MS2 parçalanmasının dekonvolüsyonu ve fragman sinyal yoğunluklarının normalleştirilmesi, her lipit camında temsil edilen her konjuge yağ asidinin toplam miktarının yaklaşık olarak tanımlanmasına ve bu verilerin maruz kalan ve kontrol grupları arasında karşılaştırılmasına izin verdi. Tamamen doymuş ve az sayıda doymamış yağ asidinde bir azalma gözlenirken, PC, PE ve PG fosfolipid sınıflarının bileşimindeki çoklu doymamış yağ asitleri sigara dumanı grubunda tüm zaman noktaları için yükselmiştir.Eikosapentaenoik ve dokosaheksaenoik asit ile konjuge edilmiş aşırı PC ve PG vakaları sadece 3R4F CS maruziyet grubunda tespit edildi. Numunenin ve QC numunesinin pipetlenmesi düşük bantlı uçlarla yapılmalı ve doğru olmalıdır, yani uçlar her numune arasında kontrol edilmelidir. Dahili standart çözümün pipetlenmesi kritik öneme sahiptir ve doğru olmalıdır.1 ila 1 diklorometan metanol çözeltisi dikkatle ele alınmalı ve numunelerde plastik polimerlerin bulunmasını önlemek için plastikleştirici olmayan uçlar kullanılmalıdır. İpuçları her numune arasında değiştirilmelidir.

Kemirgen Dokularının Av Tüfeği Lipidomikleri

Abstract