建立胰腺癌斑马鱼患者来源的异种移植物进行化学敏感性测试

Summary

临床前模型旨在提高癌症生物学知识并预测治疗效果。本文描述了基于斑马鱼的患者来源的带有肿瘤组织碎片的异种移植物（zPDX）的产生。zPDXs用化疗治疗，根据移植组织的细胞凋亡评估其治疗效果。

Abstract

癌症是全世界死亡的主要原因之一，许多类型癌症的发病率继续增加。在筛查、预防和治疗方面取得了很大进展;然而，仍然缺乏预测癌症患者化学敏感性特征的临床前模型。为了填补这一空白，开发并验证了一种 体内 患者衍生的异种移植模型。该模型基于受精后2天的斑马鱼 （Danio rerio） 胚胎，这些胚胎被用作从患者手术标本中提取的肿瘤组织的异种移植片段的接受者。

还值得注意的是，生物样本没有被消化或分解，以维持肿瘤微环境，这对于分析肿瘤行为和对治疗的反应至关重要。该协议详细介绍了一种从原发性实体瘤手术切除中建立基于斑马鱼的患者来源异种移植物（zPDX）的方法。经解剖病理学家筛选后，使用手术刀刀片解剖标本。去除坏死组织、血管或脂肪组织，然后切成 0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mm 的碎片。

然后将这些碎片进行荧光标记并异种移植到斑马鱼胚胎的周围空间中。可以低成本处理大量胚胎，从而能够对zPDX对多种抗癌药物的化学敏感性进行高通量 体内分析 。常规采集共聚焦图像以检测和量化化疗诱导的凋亡水平与对照组相比。异种移植程序具有显着的时间优势，因为它可以在一天内完成，为进行联合临床试验的治疗筛选提供了合理的时间窗口。

Introduction

临床癌症研究的一个问题是，癌症不是一种单一的疾病，而是可以随着时间的推移而演变的各种不同的疾病，需要根据肿瘤本身^{和患者的特点}进行特定的治疗1。因此，挑战在于转向以患者为导向的癌症研究，以便为癌症治疗结果的早期预测确定新的个性化策略²。这与胰腺导管腺癌（PDAC）尤其相关，因为它被认为是一种难以治疗的癌症，5年生存率为11%³。

诊断较晚、进展迅速、缺乏有效治疗仍然是PDAC最紧迫的临床问题。因此，主要的挑战是对患者进行建模并确定可在临床中应用的生物标志物，以选择符合个性化医疗^的最有效疗法4，^5，6。随着时间的推移，已经提出了新的方法来模拟癌症疾病：患者来源的类器官（PDO）和小鼠患者来源的异种移植物（mPDX）起源于人类肿瘤组织的来源。它们已被用于复制疾病以研究对治疗的反应和抵抗力，以及疾病复发⁷，^8，9。

同....

Protocol

意大利公共卫生部根据关于动物使用和护理的指令2010/63 / EU批准了所有描述的动物实验。当地伦理委员会批准了这项研究，注册号为70213。从所有相关受试者获得知情同意。在开始之前，应准备好所有溶液和设备（第1节），并应将鱼穿过（第2节）。

1. 溶液和设备的准备

注：有关要制备的溶液和培养基，请参见 表1 。

1. 琼?.......

Discussion

癌症研究中的体内模型为了解癌症生物学和预测癌症治疗反应提供了宝贵的工具。目前，可以使用不同的体内模型，例如转基因动物（转基因和敲除小鼠）或来自人类原代细胞的患者来源的异种移植物。尽管有许多最佳功能，但每个功能都有各种限制。特别是，上述模型缺乏一种可靠的方法来模拟患者的肿瘤组织微环境。

有人提出，肿瘤微环境可能在药物反应?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Teva Pharma AG	SMP 1532755
48 multiwell plate	Sarstedt	83 3923
96 multiwell plate	Sarstedt	82.1581.001
Acetone	Merck	179124
Agarose powder	Merck	A9539
Amphotericin	Thermo Fisher Scientific	15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Merck	MAB1281	1:200 dilution
Aquarium net QN6	Penn-plax	0-30172-23006-6
BSA	Merck	A9418
CellTrace	Thermo Fisher Scientific	C34567
CellTracker CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C7001
CellTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	9661S	1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	PanReac AppliChem ITW Reagents	A3672,0250
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	501985
Folinic acid -  Lederfolin	Pfizer
Glass capillaries, 3.5"	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.
Glass vials	VWR International	WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244	1:500 dilution
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	31872
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Irinotecan	Hospira
Low Temperature Freezer Vials	VWR International	479-1220
McIlwain Tissue Chopper	World Precision Instruments
Microplate Mixer	SCILOGEX	822000049999
Oxaliplatin	Teva
Paraformaldehyde	Merck	P6148-500G
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190094
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish 100 mm	Sarstedt	83 3902500
Petri dish 60 mm	Sarstedt	83 3901
Plastic Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171.010
Poly-Mount	Tebu-bio	18606-5
Propidium iodide	Merck	P4170
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel	VWR International	SWAN3001
Scalpel handle #3	World Precision Instruments	500236
Tricaine	Merck	E10521
Triton X-100	Merck	T8787
Tween 20	Merck	P9416
Vertical Micropipette Puller	Shutter instrument	P-30