Etablering av sebrafisk pasientderiverte xenotransplantater fra bukspyttkjertelkreft for kjemosensitivitetstesting

Summary

Prekliniske modeller tar sikte på å fremme kunnskapen om kreftbiologi og forutsi behandlingseffekt. Denne artikkelen beskriver genereringen av sebrafiskbaserte pasientderiverte xenotransplantater (zPDX) med tumorvevsfragmenter. ZPDX-ene ble behandlet med kjemoterapi, hvis terapeutiske effekt ble vurdert med hensyn til celleapoptose i det transplanterte vevet.

Abstract

Kreft er en av de viktigste dødsårsakene over hele verden, og forekomsten av mange typer kreft fortsetter å øke. Mye fremgang har blitt gjort når det gjelder screening, forebygging og behandling; Imidlertid mangler fortsatt prekliniske modeller som forutsier kjemosensitivitetsprofilen til kreftpasienter. For å fylle dette gapet ble en in vivo pasientderivert xenograftmodell utviklet og validert. Modellen var basert på sebrafisk (Danio rerio) embryoer 2 dager etter befruktning, som ble brukt som mottakere av xenograftfragmenter av tumorvev tatt fra pasientens kirurgiske prøve.

Det er også verdt å merke seg at bioptiske prøver ikke ble fordøyd eller disaggregert for å opprettholde tumormikromiljøet, noe som er avgjørende når det gjelder å analysere tumoradferd og respons på terapi. Protokollen beskriver en metode for å etablere sebrafiskbaserte pasientderiverte xenotransplantater (zPDX) fra primær solid tumor kirurgisk reseksjon. Etter screening av en anatomopatolog, blir prøven dissekert ved hjelp av et skalpellblad. Nekrotisk vev, kar eller fettvev fjernes og hakkes deretter i 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm stykker.

Bitene blir deretter fluorescerende merket og xenotransplantert inn i perivitellinerommet til sebrafiskembryoer. Et stort antall embryoer kan behandles til en lav kostnad, noe som muliggjør høy gjennomstrømning in vivo-analyser av kjemosensitiviteten til zPDX for flere kreftmedisiner. Konfokale bilder blir rutinemessig anskaffet for å oppdage og kvantifisere de apoptotiske nivåene indusert av kjemoterapibehandling sammenlignet med kontrollgruppen. Xenograft-prosedyren har en betydelig tidsfordel, siden den kan fullføres på en enkelt dag, noe som gir et rimelig tidsvindu for å utføre en terapeutisk screening for samtidige kliniske studier.

Introduction

Et av problemene med klinisk kreftforskning er at kreft ikke er en enkelt sykdom, men en rekke forskjellige sykdommer som kan utvikle seg over tid, og krever spesifikke behandlinger avhengig av egenskapene til selve svulsten og pasienten¹. Følgelig er utfordringen å bevege seg mot pasientorientert kreftforskning, for å identifisere nye personlige strategier for tidlig prediksjon av kreftbehandlingsresultater². Dette er spesielt relevant for bukspyttkjertelduktalt adenokarsinom (PDAC), siden det regnes som en vanskelig å behandle kreft, med en 5-års overlevelsesrate på 11%³.

Protocol

Det italienske folkehelsedepartementet godkjente alle dyreforsøkene som ble beskrevet, i samsvar med direktiv 2010/63/EU om bruk og stell av dyr. Den lokale etiske komiteen godkjente studien, under registreringsnummer 70213. Informert samtykke ble innhentet fra alle involverte personer. Før start skal alle løsninger og utstyr klargjøres (del 1) og fisken krysses (seksjon 2).

1. Klargjøring av løsninger og utstyr

MERK: Se tabell 1

Discussion

In vivo-modeller innen kreftforskning gir uvurderlige verktøy for å forstå kreftbiologi og forutsi kreftbehandlingsresponsen. For tiden er forskjellige in vivo-modeller tilgjengelige, for eksempel genetisk modifiserte dyr (transgene og knockoutmus) eller pasientavledede xenotransplantater fra humane primære celler. Til tross for mange optimale funksjoner, har hver og en forskjellige begrensninger. Spesielt mangler de nevnte modellene en pålitelig måte å etterligne pasientens tumorvevsmikromiljø .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Teva Pharma AG	SMP 1532755
48 multiwell plate	Sarstedt	83 3923
96 multiwell plate	Sarstedt	82.1581.001
Acetone	Merck	179124
Agarose powder	Merck	A9539
Amphotericin	Thermo Fisher Scientific	15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Merck	MAB1281	1:200 dilution
Aquarium net QN6	Penn-plax	0-30172-23006-6
BSA	Merck	A9418
CellTrace	Thermo Fisher Scientific	C34567
CellTracker CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C7001
CellTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	9661S	1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	PanReac AppliChem ITW Reagents	A3672,0250
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	501985
Folinic acid -  Lederfolin	Pfizer
Glass capillaries, 3.5"	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.
Glass vials	VWR International	WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244	1:500 dilution
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	31872
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Irinotecan	Hospira
Low Temperature Freezer Vials	VWR International	479-1220
McIlwain Tissue Chopper	World Precision Instruments
Microplate Mixer	SCILOGEX	822000049999
Oxaliplatin	Teva
Paraformaldehyde	Merck	P6148-500G
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190094
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish 100 mm	Sarstedt	83 3902500
Petri dish 60 mm	Sarstedt	83 3901
Plastic Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171.010
Poly-Mount	Tebu-bio	18606-5
Propidium iodide	Merck	P4170
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel	VWR International	SWAN3001
Scalpel handle #3	World Precision Instruments	500236
Tricaine	Merck	E10521
Triton X-100	Merck	T8787
Tween 20	Merck	P9416
Vertical Micropipette Puller	Shutter instrument	P-30