Etablering av zebrafisk patient-derived xenografts från bukspottskörtelcancer för kemosensitivitetstestning

Summary

Prekliniska modeller syftar till att öka kunskapen om cancerbiologi och förutsäga behandlingseffekt. Denna artikel beskriver genereringen av zebrafiskbaserade patient-derived xenografts (zPDX) med tumörvävnadsfragment. ZPDX behandlades med kemoterapi, vars terapeutiska effekt bedömdes med avseende på cellapoptos av den transplanterade vävnaden.

Abstract

Cancer är en av de främsta dödsorsakerna i världen, och förekomsten av många typer av cancer fortsätter att öka. Stora framsteg har gjorts när det gäller screening, förebyggande och behandling. Prekliniska modeller som förutsäger kemosensitivitetsprofilen hos cancerpatienter saknas dock fortfarande. För att fylla detta gap utvecklades och validerades en in vivo patient-härledd xenograftmodell. Modellen baserades på zebrafiskembryon (Danio rerio) 2 dagar efter befruktning, som användes som mottagare av xenograftfragment av tumörvävnad som tagits från en patients kirurgiska prov.

Det är också värt att notera att bioptiska prover inte smältes eller disaggregerades för att upprätthålla tumörmikromiljön, vilket är avgörande när det gäller att analysera tumörbeteende och svaret på terapi. Protokollet beskriver en metod för att etablera zebrafiskbaserade patient-derived xenografts (zPDX) från primär solid tumörkirurgisk resektion. Efter screening av en anatomipatolog dissekeras provet med hjälp av ett skalpellblad. Nekrotisk vävnad, kärl eller fettvävnad avlägsnas och hackas sedan i 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm bitar.

Bitarna märks sedan fluorescerande och xenotransplanteras in i perivitellinutrymmet hos zebrafiskembryon. Ett stort antal embryon kan bearbetas till en låg kostnad, vilket möjliggör in vivo-analyser med hög genomströmning av zPDX: s kemosensitivitet för flera cancerläkemedel. Konfokala bilder förvärvas rutinmässigt för att detektera och kvantifiera de apoptotiska nivåerna inducerade av kemoterapibehandling jämfört med kontrollgruppen. Xenograft-proceduren har en betydande tidsfördel, eftersom den kan slutföras på en enda dag, vilket ger ett rimligt tidsfönster för att genomföra en terapeutisk screening för samkliniska prövningar.

Introduction

Ett av problemen med klinisk cancerforskning är att cancer inte är en enda sjukdom, utan en mängd olika sjukdomar som kan utvecklas över tiden, vilket kräver specifika behandlingar beroende på tumörens egenskaper och patienten¹. Följaktligen är utmaningen att gå mot patientorienterad cancerforskning för att identifiera nya personliga strategier för tidig förutsägelse av cancerbehandlingsresultat². Detta är särskilt relevant för pankreas duktalt adenokarcinom (PDAC), eftersom det anses vara en svårbehandlad cancer, med en 5-årig överlevnad på 11%³.

Den sena diagnosen, sn....

Protocol

Det italienska folkhälsoministeriet godkände alla beskrivna djurförsök, i enlighet med direktiv 2010/63/EU om användning och skötsel av djur. Den lokala etiska kommittén godkände studien med registreringsnummer 70213. Informerat samtycke erhölls från alla inblandade ämnen. Innan du börjar ska alla lösningar och utrustning förberedas (avsnitt 1) och fisken ska korsas (avsnitt 2).

1. Beredning av lösningar och utrustning

OBS: Se t.......

Discussion

In vivo-modeller inom cancerforskning ger ovärderliga verktyg för att förstå cancerbiologi och förutsäga cancerbehandlingssvaret. För närvarande finns olika in vivo-modeller tillgängliga, till exempel genetiskt modifierade djur (transgena möss och knockoutmöss) eller patienthärledda xenotransplantat från humana primära celler. Trots många optimala funktioner har var och en olika begränsningar. I synnerhet saknar de ovannämnda modellerna ett tillförlitligt sätt att efterlikna patienten.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Teva Pharma AG	SMP 1532755
48 multiwell plate	Sarstedt	83 3923
96 multiwell plate	Sarstedt	82.1581.001
Acetone	Merck	179124
Agarose powder	Merck	A9539
Amphotericin	Thermo Fisher Scientific	15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Merck	MAB1281	1:200 dilution
Aquarium net QN6	Penn-plax	0-30172-23006-6
BSA	Merck	A9418
CellTrace	Thermo Fisher Scientific	C34567
CellTracker CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C7001
CellTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	9661S	1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	PanReac AppliChem ITW Reagents	A3672,0250
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	501985
Folinic acid -  Lederfolin	Pfizer
Glass capillaries, 3.5"	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.
Glass vials	VWR International	WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244	1:500 dilution
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	31872
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Irinotecan	Hospira
Low Temperature Freezer Vials	VWR International	479-1220
McIlwain Tissue Chopper	World Precision Instruments
Microplate Mixer	SCILOGEX	822000049999
Oxaliplatin	Teva
Paraformaldehyde	Merck	P6148-500G
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190094
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish 100 mm	Sarstedt	83 3902500
Petri dish 60 mm	Sarstedt	83 3901
Plastic Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171.010
Poly-Mount	Tebu-bio	18606-5
Propidium iodide	Merck	P4170
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel	VWR International	SWAN3001
Scalpel handle #3	World Precision Instruments	500236
Tricaine	Merck	E10521
Triton X-100	Merck	T8787
Tween 20	Merck	P9416
Vertical Micropipette Puller	Shutter instrument	P-30