Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Preklinische modellen zijn bedoeld om de kennis van kankerbiologie te vergroten en de werkzaamheid van de behandeling te voorspellen. Dit artikel beschrijft de generatie van op zebravissen gebaseerde patiënt-afgeleide xenografts (zPDXs) met tumorweefselfragmenten. De zPDXs werden behandeld met chemotherapie, waarvan het therapeutische effect werd beoordeeld in termen van celapoptose van het getransplanteerde weefsel.

Abstract

Kanker is wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken en de incidentie van vele soorten kanker blijft toenemen. Er is veel vooruitgang geboekt op het gebied van screening, preventie en behandeling; Preklinische modellen die het chemosensitiviteitsprofiel van kankerpatiënten voorspellen, ontbreken echter nog. Om deze leemte op te vullen, werd een in vivo patiënt-afgeleid xenograftmodel ontwikkeld en gevalideerd. Het model was gebaseerd op zebravis (Danio rerio) embryo's op 2 dagen na de bevruchting, die werden gebruikt als ontvangers van xenograft fragmenten van tumorweefsel genomen van het chirurgische monster van een patiënt.

Het is ook vermeldenswaard dat bioptische monsters niet werden verteerd of uitgesplitst, om de micro-omgeving van de tumor te behouden, wat cruciaal is in termen van het analyseren van tumorgedrag en de respons op therapie. Het protocol beschrijft een methode voor het vaststellen van op zebravissen gebaseerde patiënt-afgeleide xenografts (zPDXs) van primaire solide tumorchirurgische resectie. Na screening door een anatomopatholoog wordt het monster ontleed met behulp van een scalpelmesje. Necrotisch weefsel, bloedvaten of vetweefsel worden verwijderd en vervolgens in stukjes van 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm gehakt.

De stukjes worden vervolgens fluorescerend gelabeld en xenotransplanteerd in de perivitellineruimte van zebravisembryo's. Een groot aantal embryo's kan tegen lage kosten worden verwerkt, waardoor in vivo analyses met een hoge doorvoer van de chemosensitiviteit van zPDX's voor meerdere geneesmiddelen tegen kanker mogelijk zijn. Confocale beelden worden routinematig verkregen om de apoptotische niveaus geïnduceerd door chemotherapiebehandeling te detecteren en te kwantificeren in vergelijking met de controlegroep. De xenograftprocedure heeft een aanzienlijk tijdsvoordeel, omdat deze in één dag kan worden voltooid, waardoor een redelijk tijdsbestek wordt geboden om een therapeutische screening voor coklinische onderzoeken uit te voeren.

Introduction

Een van de problemen van klinisch kankeronderzoek is dat kanker geen enkele ziekte is, maar een verscheidenheid aan verschillende ziekten die in de loop van de tijd kunnen evolueren en specifieke behandelingen vereisen, afhankelijk van de kenmerken van de tumor zelf en de patiënt1. Bijgevolg is de uitdaging om naar patiëntgericht kankeronderzoek te gaan, om nieuwe gepersonaliseerde strategieën te identificeren voor de vroege voorspelling van kankerbehandelingsresultaten2. Dit is met name relevant voor pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC), omdat het wordt beschouwd als een moeilijk te behandelen kanker, met een 5-jaarso....

Protocol

Het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid heeft alle beschreven dierproeven goedgekeurd, in overeenstemming met richtlijn 2010/63/EU betreffende het gebruik en de verzorging van dieren. De lokale ethische commissie keurde de studie goed, onder registratienummer 70213. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle betrokkenen. Voordat u begint, moeten alle oplossingen en de apparatuur worden voorbereid (sectie 1) en moeten de vissen worden gekruist (sectie 2).

1. Bereiding van op.......

Representative Results

Dit protocol beschrijft de experimentele benadering voor het vaststellen van zPDX's van primair humaan pancreas adenocarcinoom. Een tumormonster werd verzameld, gehakt en gekleurd met behulp van fluorescerende kleurstof, zoals beschreven in protocolsectie 4. zPDX's werden vervolgens met succes vastgesteld door implantatie van een stuk tumor in de perivitellineruimte van 2 DPF-zebravisembryo's, zoals beschreven in protocolsectie 5. Zoals beschreven in protocolsectie 6, werden de zPDX's verder gescreend om de chemotherapie.......

Discussion

In vivo modellen in kankeronderzoek bieden onschatbare hulpmiddelen om kankerbiologie te begrijpen en de respons op kankerbehandeling te voorspellen. Momenteel zijn er verschillende in vivo modellen beschikbaar, bijvoorbeeld genetisch gemodificeerde dieren (transgene en knock-out muizen) of van patiënten afgeleide xenografts uit menselijke primaire cellen. Ondanks vele optimale functies, heeft elk ervan verschillende beperkingen. In het bijzonder missen de bovengenoemde modellen een betrouwbare manier .......

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door Fondazione Pisa (project 114/16). De auteurs willen Raffaele Gaeta van de Histopathologie Unit van Azienda Ospedaliera Pisana bedanken voor de selectie van patiëntenmonsters en pathologieondersteuning. We bedanken ook Alessia Galante voor de technische ondersteuning bij de experimenten. Dit artikel is gebaseerd op werk van COST Action TRANSPAN, CA21116, ondersteund door COST (European Cooperation in Science and Technology).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5-fluorouracilTeva Pharma AGSMP 1532755
48 multiwell plateSarstedt83 3923
96 multiwell plateSarstedt82.1581.001
AcetoneMerck179124
Agarose powder MerckA9539
AmphotericinThermo Fisher Scientific15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1MerckMAB1281 1:200 dilution
Aquarium net QN6Penn-plax0-30172-23006-6
BSAMerckA9418
CellTraceThermo Fisher ScientificC34567
CellTracker CM-DiI Thermo Fisher ScientificC7001
CellTracker Deep Red Thermo Fisher ScientificC34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAbCell Signaling Technology9661S1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO) PanReac AppliChem ITW ReagentsA3672,0250
Dumont #5 forcepsWorld Precision Instruments501985
Folinic acid -  LederfolinPfizer
Glass capillaries, 3.5"Drummond Scientific Company3-000-203-G/XOuter diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. 
Glass vials VWR InternationalWHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA-21244  1:500 dilution
Goat serumThermo Fisher Scientific31872
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
IrinotecanHospira
Low Temperature Freezer VialsVWR International479-1220
McIlwain Tissue ChopperWorld Precision Instruments
Microplate MixerSCILOGEX822000049999
OxaliplatinTeva
ParaformaldehydeMerckP6148-500G
PBSThermo Fisher Scientific14190094
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher Scientific15140122
Petri dish 100 mmSarstedt83 3902500
Petri dish 60 mmSarstedt83 3901
Plastic Pasteur pipetteSarstedt86.1171.010
Poly-MountTebu-bio18606-5
Propidium iodideMerckP4170
RPMI-1640 mediumThermo Fisher Scientific11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless SteelVWR InternationalSWAN3001
Scalpel handle #3World Precision Instruments500236
TricaineMerckE10521
Triton X-100 MerckT8787
Tween 20MerckP9416
Vertical Micropipette PullerShutter instrumentP-30 

References

  1. Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
  2. Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).<....

This article has been published

Video Coming Soon

We use cookies to enhance your experience on our website.

By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.

Learn More