הקמת קסנוגרפטים מסרטן הלבלב שמקורם בדגי זברה לבדיקת רגישות לכימותרפיה

Summary

מודלים פרה-קליניים נועדו לקדם את הידע בביולוגיה של סרטן ולחזות את יעילות הטיפול. מאמר זה מתאר את הדור של xenografts מבוססי דגי זברה שמקורם בחולה (zPDXs) עם שברי רקמת גידול. zPDXs טופלו בכימותרפיה, שהשפעתה הטיפולית הוערכה במונחים של אפופטוזיס תאי של הרקמה המושתלת.

Abstract

סרטן הוא אחד הגורמים העיקריים למוות ברחבי העולם, והשכיחות של סוגים רבים של סרטן ממשיכה לעלות. התקדמות רבה הושגה במונחים של סינון, מניעה וטיפול; עם זאת, מודלים פרה-קליניים המנבאים את פרופיל הרגישות הכימותרפית של חולי סרטן עדיין חסרים. כדי למלא את הפער הזה, פותח ואומת מודל קסנוגרפט שמקורו במטופל in vivo . המודל התבסס על עוברים של דגי זברה (Danio rerio) יומיים לאחר ההפריה, אשר שימשו כמושתלים של שברי קסנוגרפט של רקמת גידול שנלקחו מדגימה כירורגית של מטופל.

ראוי גם לציין כי דגימות ביופטיות לא עוכלו או התפרקו, על מנת לשמור על המיקרו-סביבה של הגידול, שהיא קריטית מבחינת ניתוח התנהגות הגידול והתגובה לטיפול. הפרוטוקול מפרט שיטה לביסוס xenografts מבוססי דגי זברה שמקורם במטופל (zPDXs) מכריתה כירורגית ראשונית של גידול מוצק. לאחר הקרנה על ידי אנטומופתולוג, הדגימה מנותחת באמצעות להב אזמל. רקמת נמק, כלי דם או רקמת שומן מוסרים ולאחר מכן קצוצים לחתיכות 0.3 מ"מ x 0.3 מ"מ x 0.3 מ"מ.

לאחר מכן החלקים מסומנים באופן פלואורסצנטי ומושתלים בחלל הפריביטלין של עוברי דגי זברה. ניתן לעבד מספר רב של עוברים בעלות נמוכה, מה שמאפשר ניתוח in vivo בתפוקה גבוהה של הרגישות הכימותרפית של zPDXs למספר תרופות אנטי-סרטניות. תמונות קונפוקליות נרכשות באופן שגרתי כדי לזהות ולכמת את רמות אפופטוטיקה המושרות על ידי טיפול כימותרפי בהשוואה לקבוצת הביקורת. הליך xenograft יש יתרון זמן משמעותי, שכן ניתן להשלים אותו ביום אחד, מתן חלון זמן סביר לבצע סינון טיפולי עבור ניסויים קליניים משותפים.

Introduction

אחת הבעיות של חקר הסרטן הקליני היא שסרטן אינו מחלה אחת, אלא מגוון מחלות שונות שיכולות להתפתח עם הזמן, ודורשות טיפולים ספציפיים בהתאם למאפייני הגידול עצמו והחולה¹. כתוצאה מכך, האתגר הוא לנוע לעבר מחקר סרטן מוכוון מטופל, על מנת לזהות אסטרטגיות מותאמות אישית חדשות לחיזוי מוקדם של תוצאות הטיפול בסרטן². זה רלוונטי במיוחד עבור אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), שכן הוא נחשב לסרטן קשה לטיפול, עם שיעור הישרדות של 5 שנים של 11%³.

האבחנה המאוחרת, ההתקדמות המהירה והיעדר טיפולים יעילים נותרו הבעיות הקליניות הדחופות ביותר של PDAC. האתגר העיקרי הוא, אם כן, למדל את המטופל ולזהות סמני....

Protocol

משרד בריאות הציבור האיטלקי אישר את כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים, בהתאם לדירקטיבה 2010/63/EU בנושא שימוש וטיפול בבעלי חיים. ועדת האתיקה המקומית אישרה את המחקר, תחת מספר רישום 70213. הסכמה מדעת התקבלה מכל הנבדקים המעורבים. לפני שמתחילים, יש להכין את כל הפתרונות והציוד (סעיף 1) ולחצות את הדגים (סעי?.......

Discussion

מודלים In vivo בחקר הסרטן מספקים כלים שלא יסולא בפז להבנת הביולוגיה של הסרטן ולחיזוי התגובה לטיפול בסרטן. כיום, מודלים שונים in vivo זמינים, למשל, בעלי חיים מהונדסים גנטית (עכברים מהונדסים ונוקאאוט) או xenografts שמקורם בחולה מתאים ראשוניים אנושיים. למרות תכונות אופטימליות רבות, לכל אחד מהם .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Teva Pharma AG	SMP 1532755
48 multiwell plate	Sarstedt	83 3923
96 multiwell plate	Sarstedt	82.1581.001
Acetone	Merck	179124
Agarose powder	Merck	A9539
Amphotericin	Thermo Fisher Scientific	15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Merck	MAB1281	1:200 dilution
Aquarium net QN6	Penn-plax	0-30172-23006-6
BSA	Merck	A9418
CellTrace	Thermo Fisher Scientific	C34567
CellTracker CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C7001
CellTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	9661S	1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	PanReac AppliChem ITW Reagents	A3672,0250
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	501985
Folinic acid -  Lederfolin	Pfizer
Glass capillaries, 3.5"	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.
Glass vials	VWR International	WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244	1:500 dilution
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	31872
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Irinotecan	Hospira
Low Temperature Freezer Vials	VWR International	479-1220
McIlwain Tissue Chopper	World Precision Instruments
Microplate Mixer	SCILOGEX	822000049999
Oxaliplatin	Teva
Paraformaldehyde	Merck	P6148-500G
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190094
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish 100 mm	Sarstedt	83 3902500
Petri dish 60 mm	Sarstedt	83 3901
Plastic Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171.010
Poly-Mount	Tebu-bio	18606-5
Propidium iodide	Merck	P4170
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel	VWR International	SWAN3001
Scalpel handle #3	World Precision Instruments	500236
Tricaine	Merck	E10521
Triton X-100	Merck	T8787
Tween 20	Merck	P9416
Vertical Micropipette Puller	Shutter instrument	P-30