化学感受性試験のためのゼブラフィッシュ患者由来膵臓癌異種移植片の樹立

Summary

前臨床モデルは、がん生物学の知識を進歩させ、治療効果を予測することを目的としています。この論文では、腫瘍組織断片を用いたゼブラフィッシュベースの患者由来異種移植片(zPDX)の生成について説明します。zPDXを化学療法で治療し、その治療効果を移植組織の細胞アポトーシスに関して評価した。

Abstract

がんは世界中の主な死因の1つであり、多くの種類のがんの発生率は増加し続けています。スクリーニング、予防、治療の面で多くの進歩が見られました。しかし、がん患者の化学感受性プロファイルを予測する前臨床モデルはまだ不足しています。このギャップを埋めるために、 in vivo 患者由来の異種移植片モデルが開発され、検証されました。このモデルは、受精後2日目のゼブラフィッシュ (Danio rerio) 胚に基づいており、患者の手術標本から採取した腫瘍組織の異種移植片断片のレシピエントとして使用されました。

腫瘍の挙動および治療への反応を分析する上で重要である腫瘍微小環境を維持するために、生体試料が消化または分解されなかったことも注目に値する。このプロトコルは、原発性固形腫瘍外科的切除からゼブラフィッシュベースの患者由来異種移植片(zPDX)を確立するための方法を詳述しています。解剖病理学者によるスクリーニングの後、標本はメスの刃を使用して解剖されます。壊死組織、血管、または脂肪組織を取り除き、0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mmの断片に切り刻みます。

次に、断片を蛍光標識し、ゼブラフィッシュ胚の卵周囲腔に異種移植します。多数の胚を低コストで処理できるため、複数の抗がん剤に対するzPDXの化学療法感受性をハイスループットにin vivo で解析することができます。共焦点画像は、対照群と比較して化学療法治療によって誘発されるアポトーシスレベルを検出および定量するために日常的に取得されます。異種移植片の手順は、1日で完了することができ、共同臨床試験の治療スクリーニングを実施するための合理的な時間枠を提供するため、時間的に大きな利点があります。

Introduction

臨床がん研究の問題点の一つは、がんが単一の疾患ではなく、時間とともに進化する様々な疾患であり、腫瘍自体や患者の特性に応じて特定の治療が必要であることです¹。したがって、課題は、がん治療の結果を早期に予測するための新しい個別化された戦略を特定するために、患者指向のがん研究に移行することです²。これは、膵管腺癌(PDAC)が治療が困難な癌と見なされ、5年生存率が11%^{であるため}、特に重要です3。

診断の遅れ、急速な進行、効果的な治療法の欠如は、PDACの最も差し迫った臨床問題のままです。したがって、主な課題は、患者をモデル化し、個別化医療に沿った最も効果的な治療法を選択するためにクリニックで適用できるバイオマーカーを特定することです^4,5,6。時が経つにつれて、がん疾患をモデル化するための新しいアプローチが提案されてきました:患者由来オルガノイド(PDO)およびヒト腫瘍組織の供給源に由来するマウス患者由来異種移植片(mPDX)。それらは、治療に対する反応と抵抗性、ならびに疾患の再発を研究するために疾患を再現するために使用されてきた

Protocol

イタリア公衆衛生省は、動物の使用と管理に関する指令2010/63 / EUに準拠して、記載されているすべての動物実験を承認しました。地元の倫理委員会は、登録番号70213で研究を承認しました。関係するすべての被験者からインフォームドコンセントが得られました。始める前に、すべての解決策と機器を準備し(セクション1)、魚を渡る必要があります(セクション2)。

1.溶液と機器の準備

メモ: 調製する溶液とメディアについては、 表 1 を参照してください。

1. アガロースゲルサポート
   1. 電子レンジ対応フラスコでアガロース粉末を秤量し、所定の量のE3ゼブラフィッシュ培地に溶解して1%ゲルを作ります。アガロースが完全に溶解するまで電子レンジで加熱します。
      注意: 溶液を沸騰させすぎないでください。
   2. 溶かしたアガロースをペトリ皿に注ぎ、ゲルが完全に固まるまで待ちます。
   3. 先端を切り取ったプラスチックパスツールピペットを使用して、小さなアガロースシリンダー(高さ~5 mm)を作ります。調製したら、アルミホイルで包んで4°Cのシャーレに保管します。
2. ガラスマイクロニードル
   1. ホウケイ酸ガラスの毛細血管をプーラーで引っ張って、細い針を取得します....

Discussion

がん研究におけるin vivoモデルは、がん生物学を理解し、がん治療反応を予測するための貴重なツールを提供します。現在、異なるin vivoモデル、例えば、遺伝子改変動物(トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウス)またはヒト初代細胞からの患者由来の異種移植片が利用可能である。多くの最適な機能にもかかわらず、それぞれにさまざまな制限があります。特に、前.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Teva Pharma AG	SMP 1532755
48 multiwell plate	Sarstedt	83 3923
96 multiwell plate	Sarstedt	82.1581.001
Acetone	Merck	179124
Agarose powder	Merck	A9539
Amphotericin	Thermo Fisher Scientific	15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Merck	MAB1281	1:200 dilution
Aquarium net QN6	Penn-plax	0-30172-23006-6
BSA	Merck	A9418
CellTrace	Thermo Fisher Scientific	C34567
CellTracker CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C7001
CellTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	9661S	1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	PanReac AppliChem ITW Reagents	A3672,0250
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	501985
Folinic acid -  Lederfolin	Pfizer
Glass capillaries, 3.5"	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.
Glass vials	VWR International	WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244	1:500 dilution
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	31872
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Irinotecan	Hospira
Low Temperature Freezer Vials	VWR International	479-1220
McIlwain Tissue Chopper	World Precision Instruments
Microplate Mixer	SCILOGEX	822000049999
Oxaliplatin	Teva
Paraformaldehyde	Merck	P6148-500G
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190094
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish 100 mm	Sarstedt	83 3902500
Petri dish 60 mm	Sarstedt	83 3901
Plastic Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171.010
Poly-Mount	Tebu-bio	18606-5
Propidium iodide	Merck	P4170
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel	VWR International	SWAN3001
Scalpel handle #3	World Precision Instruments	500236
Tricaine	Merck	E10521
Triton X-100	Merck	T8787
Tween 20	Merck	P9416
Vertical Micropipette Puller	Shutter instrument	P-30