화학감수성 검사를 위한 췌장암의 Zebrafish 환자 유래 이종이식편 구축

Summary

전임상 모델은 암 생물학에 대한 지식을 발전시키고 치료 효능을 예측하는 것을 목표로 합니다. 이 논문은 종양 조직 조각이 있는 제브라피쉬 기반 환자 유래 이종이식(zPDX)의 생성에 대해 설명합니다. zPDX는 화학 요법으로 치료되었으며, 이식 된 조직의 세포 사멸 측면에서 치료 효과를 평가했습니다.

Abstract

암은 전 세계적으로 주요 사망 원인 중 하나이며 많은 유형의 암 발병률이 계속 증가하고 있습니다. 선별, 예방 및 치료 측면에서 많은 진전이 이루어졌습니다. 그러나 암 환자의 화학감수성 프로파일을 예측하는 전임상 모델은 아직 부족하다. 이 격차를 메우기 위해 생체 내 환자 유래 이종이식 모델을 개발하고 검증했습니다. 이 모델은 수정 후 2일째의 제브라피쉬 (Danio rerio) 배아를 기반으로 했으며, 이는 환자의 수술 표본에서 채취한 종양 조직의 이종이식 단편의 수용자로 사용되었습니다.

또한 종양 거동 및 치료에 대한 반응 분석 측면에서 중요한 종양 미세 환경을 유지하기 위해 바이옵틱 샘플이 소화되거나 분해되지 않았다는 점도 주목할 가치가 있습니다. 이 프로토콜은 원발성 고형 종양 외과적 절제술에서 제브라피쉬 기반 환자 유래 이종이식(zPDX)을 확립하는 방법을 자세히 설명합니다. 해부병리학자가 스크리닝한 후 메스 칼날을 사용하여 표본을 해부합니다. 괴사 조직, 혈관 또는 지방 조직을 제거한 다음 0.3mm x 0.3mm x 0.3mm 조각으로 자릅니다.

그런 다음 조각은 형광으로 표지되고 제브라피쉬 배아의 perivitelline 공간에 이종 이식됩니다. 많은 수의 배아를 저렴한 비용으로 처리할 수 있어 여러 항암제에 대한 zPDX의 화학민감도에 대한 생체 내 고처리량 분석이 가능합니다. 공초점 이미지는 대조군과 비교하여 화학 요법 치료에 의해 유도된 세포사멸 수준을 감지하고 정량화하기 위해 일상적으로 획득됩니다. 이종이식 시술은 하루 만에 완료할 수 있어 공동 임상 시험을 위한 치료 스크리닝을 수행할 수 있는 합리적인 시간 창을 제공하기 때문에 상당한 시간 이점이 있습니다.

Introduction

임상암 연구의 문제점 중 하나는 암이 하나의 질병이 아니라 시간이 지남에 따라 진화할 수 있는 다양한 질병으로 종양 자체와 환자의 특성에 따라 구체적인 치료가 필요하다는 점이다¹. 결과적으로, 암 치료 결과의 조기 예측을 위한 새로운 개인화된 전략을 식별하기 위해 환자 중심의 암 연구로 나아가는 것이 과제입니다². 이것은 5년 생존율이 11^%3로 치료하기 어려운 암으로 간주되기 때문에 췌관 선암종(PDAC)과 특히 관련이 있습니다.

늦은 진단, 빠른 진행 및 효과적인 치료법의 부족은 PDAC의 가장 시급한 임상 문제로 남아 있습니다. 따라서 주요 과제는 환자를 모델링하고 개인화 된 의학 ^4,5,6에 따라 가장 효과적인 치료법을 선택하기 위해 클리닉에 적용 할 수있는 바이오 마커를 식별하는 것입니다. 시간이 지남에 따라 암 질환을 모델링하기 위한 새로운 접근 방식이 제안되었습니다: 환자 유래 오가노이드(PDO) 및 마우스 환자 유래 이종이식(mPDX)은....

Protocol

이탈리아 공중 보건부는 동물 사용 및 관리에 관한 지침 2010/63/EU에 따라 설명된 모든 동물 실험을 승인했습니다. 지역 윤리위원회는 등록 번호 70213으로 연구를 승인했습니다. 관련된 모든 피험자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 시작하기 전에 모든 솔루션과 장비를 준비하고(섹션 1) 물고기를 건너야 합니다(섹션 2).

1. 용액 및 장비 준비

Discussion

암 연구의 생체 내 모델은 암 생물학을 이해하고 암 치료 반응을 예측하는 데 매우 유용한 도구를 제공합니다. 현재, 상이한 생체내 모델, 예를 들어 유전자 변형 동물(형질전환 및 녹아웃 마우스) 또는 인간 일차 세포로부터의 환자 유래 이종이식(heterografts)을 이용할 수 있다. 많은 최적의 기능에도 불구하고 각 기능에는 다양한 제한 사항이 있습니다. 특히, 전술한 모델은 환자의 종?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Teva Pharma AG	SMP 1532755
48 multiwell plate	Sarstedt	83 3923
96 multiwell plate	Sarstedt	82.1581.001
Acetone	Merck	179124
Agarose powder	Merck	A9539
Amphotericin	Thermo Fisher Scientific	15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Merck	MAB1281	1:200 dilution
Aquarium net QN6	Penn-plax	0-30172-23006-6
BSA	Merck	A9418
CellTrace	Thermo Fisher Scientific	C34567
CellTracker CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C7001
CellTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	9661S	1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	PanReac AppliChem ITW Reagents	A3672,0250
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	501985
Folinic acid -  Lederfolin	Pfizer
Glass capillaries, 3.5"	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.
Glass vials	VWR International	WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244	1:500 dilution
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	31872
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Irinotecan	Hospira
Low Temperature Freezer Vials	VWR International	479-1220
McIlwain Tissue Chopper	World Precision Instruments
Microplate Mixer	SCILOGEX	822000049999
Oxaliplatin	Teva
Paraformaldehyde	Merck	P6148-500G
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190094
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish 100 mm	Sarstedt	83 3902500
Petri dish 60 mm	Sarstedt	83 3901
Plastic Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171.010
Poly-Mount	Tebu-bio	18606-5
Propidium iodide	Merck	P4170
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel	VWR International	SWAN3001
Scalpel handle #3	World Precision Instruments	500236
Tricaine	Merck	E10521
Triton X-100	Merck	T8787
Tween 20	Merck	P9416
Vertical Micropipette Puller	Shutter instrument	P-30