Создание ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с рыбками данио, из рака поджелудочной железы для тестирования на химиочувствительность

Summary

Доклинические модели направлены на расширение знаний о биологии рака и прогнозирование эффективности лечения. В этой статье описывается генерация ксенотрансплантатов пациента (zPDX) на основе рыбок данио-рерио с фрагментами опухолевой ткани. Лечение zPDX проводили химиотерапией, терапевтический эффект которой оценивали с точки зрения клеточного апоптоза трансплантированной ткани.

Abstract

Рак является одной из основных причин смерти во всем мире, и заболеваемость многими видами рака продолжает расти. Значительный прогресс был достигнут с точки зрения скрининга, профилактики и лечения; Тем не менее, доклинические модели, которые предсказывают профиль химиочувствительности онкологических больных, все еще отсутствуют. Чтобы восполнить этот пробел, была разработана и проверена модель ксенотрансплантата, полученная от пациента in vivo . Модель была основана на эмбрионах рыбок данио-рерио (Danio rerio) через 2 дня после оплодотворения, которые использовались в качестве реципиентов ксенотрансплантатных фрагментов опухолевой ткани, взятых из хирургического образца пациента.

Также стоит отметить, что биоптические образцы не были переварены или дезагрегированы, чтобы сохранить микроокружение опухоли, что имеет решающее значение с точки зрения анализа поведения опухоли и ответа на терапию. В протоколе подробно описан метод получения ксенотрансплантатов пациента (zPDX) на основе рыбок данио-рерио после хирургической резекции первичной солидной опухоли. После скрининга у анатомопатолога образец препарируют с помощью лезвия скальпеля. Некротизированная ткань, сосуды или жировая ткань удаляются, а затем измельчаются на кусочки размером 0,3 мм x 0,3 мм x 0,3 мм.

Затем кусочки флуоресцентно маркируют и ксенотрансплантируют в перивителлиновое пространство эмбрионов рыбок данио. Большое количество эмбрионов может быть обработано с низкими затратами, что позволяет проводить высокопроизводительный анализ in vivo химиочувствительности zPDX к нескольким противоопухолевым препаратам. Конфокальные изображения обычно получаются для обнаружения и количественной оценки уровней апоптоза, вызванных химиотерапией, по сравнению с контрольной группой. Процедура ксенотрансплантата имеет значительное преимущество во времени, поскольку она может быть завершена за один день, что обеспечивает разумное временное окно для проведения терапевтического скрининга для совместных клинических испытаний.

Introduction

Одна из проблем клинических исследований рака заключается в том, что рак – это не отдельное заболевание, а множество различных заболеваний, которые могут развиваться с течением времени, требуя специфических методов лечения в зависимости от особенностей самой опухоли^{и пациента1}. Следовательно, задача состоит в том, чтобы перейти к исследованиям рака, ориентированным на пациента, чтобы определить новые персонализированные стратегии для раннего прогнозирования результатов лечения рака². Это особенно актуально для аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PDAC), поскольку она считается трудно поддающимся лечению раком с ....

Protocol

Министерство здравоохранения Италии одобрило все описанные эксперименты на животных в соответствии с Директивой 2010/63/ЕС об использовании животных и уходе за ними. Местный этический комитет одобрил исследование под регистрационным номером 70213. Информированное согласие было получено ?.......

Discussion

Модели in vivo в исследованиях рака предоставляют бесценные инструменты для понимания биологии рака и прогнозирования ответа на лечение рака. В настоящее время доступны различные модели in vivo , например, генетически модифицированные животные (трансгенные и нокаутные мыши) или кс.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Teva Pharma AG	SMP 1532755
48 multiwell plate	Sarstedt	83 3923
96 multiwell plate	Sarstedt	82.1581.001
Acetone	Merck	179124
Agarose powder	Merck	A9539
Amphotericin	Thermo Fisher Scientific	15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Merck	MAB1281	1:200 dilution
Aquarium net QN6	Penn-plax	0-30172-23006-6
BSA	Merck	A9418
CellTrace	Thermo Fisher Scientific	C34567
CellTracker CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C7001
CellTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	9661S	1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	PanReac AppliChem ITW Reagents	A3672,0250
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	501985
Folinic acid -  Lederfolin	Pfizer
Glass capillaries, 3.5"	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.
Glass vials	VWR International	WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244	1:500 dilution
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	31872
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Irinotecan	Hospira
Low Temperature Freezer Vials	VWR International	479-1220
McIlwain Tissue Chopper	World Precision Instruments
Microplate Mixer	SCILOGEX	822000049999
Oxaliplatin	Teva
Paraformaldehyde	Merck	P6148-500G
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190094
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish 100 mm	Sarstedt	83 3902500
Petri dish 60 mm	Sarstedt	83 3901
Plastic Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171.010
Poly-Mount	Tebu-bio	18606-5
Propidium iodide	Merck	P4170
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel	VWR International	SWAN3001
Scalpel handle #3	World Precision Instruments	500236
Tricaine	Merck	E10521
Triton X-100	Merck	T8787
Tween 20	Merck	P9416
Vertical Micropipette Puller	Shutter instrument	P-30