A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כאן אנו מספקים הליך מפורט לייצור, טיהור וכימות של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה. פרוטוקול זה מניב באופן עקבי > 6 × 109 יחידות יוצרות פלאק/מ"ל, ומספק כמויות נגיפיות המתאימות למחקרים בבעלי חיים in vivo . מתוארים מבחני בקרת איכות נוספים להבטחת בטיחות in vivo .
נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), הידוע גם בשם אורתובולה עופות serotype-1, הוא נגיף RNA חד-גדילי בעל חוש שלילי שפותח הן כנגיף אונקוליטי והן כחיסון בעל וקטור נגיפי. NDV הוא סוכן טיפולי ומניעה אטרקטיבי בשל מערכת הגנטיקה ההפוכה המבוססת היטב שלו, תכונות אימונוסטימולטוריות חזקות ופרופיל בטיחות מעולה. כאשר הוא ניתן כנגיף אונקוליטי או כחיסון בעל וקטור נגיפי, NDV מעורר תגובה חיסונית חזקה של אנטיטומור או אנטיגן ספציפי, ומפעיל הן את הזרוע המולדת והן את הזרוע הנרכשת של מערכת החיסון.
בהתחשב במאפיינים רצויים אלה, NDV הוערך בניסויים קליניים רבים והוא אחד הנגיפים האונקוליטיים הנחקרים ביותר. נכון לעכשיו, ישנם שני ניסויים קליניים רשומים הכוללים NDV: אחד המעריך חיסון רקומביננטי בעל וקטור NDV עבור SARS-CoV-2 (NCT04871737), והשני מעריך קידוד NDV רקומביננטי אינטרלוקין-12 בשילוב עם Durvalumab, נוגדן antiPD-L1 (NCT04613492). כדי להקל על התקדמות נוספת של הווקטור הנגיפי המבטיח ביותר הזה, יש צורך בשיטות פשוטות ליצירת NDV רקומביננטי (rNDV) ברמה גבוהה, בדרגה in vivo.
מאמר זה מתאר הליך מפורט להגברת rNDV בביצי עוף עובריות ללא פתוגנים (SPF) וטיהור rNDV מנוזל אלנטואי, עם שיפורים להפחתת האובדן במהלך הטיהור. כמו כן נכללים תיאורים של מבחני בקרת האיכות המומלצים, אשר יש לבצע כדי לאשר חוסר מזהמים ושלמות הנגיף. באופן כללי, הליך מפורט זה מאפשר סינתזה, טיהור ואחסון של NDV ברמה גבוהה, בדרגה in vivo, רקומביננטית, לנטוגנית ומזוזנית לשימוש במחקרים פרה-קליניים.
נגיף מחלת ניוקאסל, הידוע גם בשם Avian Orthoavulavirus-1, הוא עטוף פרמיקסווירוס עופות בעל פוטנציאל לשמש הן כנגיף אונקוליטי והן כחיסון בעל וקטור נגיפי 1,2,3,4,4,5,6,7. לאחרונה, NDV שתוכנן לבטא את חלבון הספייק של SARS-CoV-2 אופיין כחיסון תוך-ורידי יעיל במודלים של אתגר עכברים ואוגרים 7,8,9. כאשר משתמשים בה כאימונותרפיה של סרטן, היא גורמת לגיוס של תאי....
כל העבודות הכרוכות בשימוש בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת גואלף בהתאם למועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים. כל העבודות מבוצעות במעבדה BioSafety Level 2 (BSL2) בקנדה שבה NDV מזוגני הוא פתוגן מקבוצת סיכון 2. כל השלבים הכרוכים בהגברה וטיהור של NDV צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי מסוג IIA למטרות בטיחות ועקרות.
1. הגברה של NDV באמצעות ביצי תרנגולת עובריות מוגדרות ללא פתוגנים
קצירת נוזל אלנטואי
מכיוון שנוזל אלנטואי נקטף מביצי תרנגולת עובריות, הוא צריך להיראות ברור ושקוף. אם הנוזל נראה אטום וצהוב, הדבר מצביע על נוכחות של מזהמים. הכללת נוזל אלנטואי זה במהלך הטיהור תעכב את תהליך הטיהור, שכן הלחץ יעלה במהירות ויעלה על 10 psi, וכתוצאה מכך גזירה של הנגיף ואובד.......
וירוסים המשמשים כחומרים טיפוליים במחקרים פרה-קליניים חייבים להיות מטוהרים מאוד כדי למנוע רעילות כאשר הם ניתנים in vivo15. אם סוכנים הרפתקנים או מזהמים אינם מוסרים, זה יכול להוביל לתגובות שליליות חמורות השוללות את ההשפעה הטיפולית של הסוכן הנגיפי28. מכיוון ש-NDV מי?.......
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
J.G.E.Y זכה במלגת דוקטורט של הקולג' הווטרינרי של אונטריו ובמלגת בוגרים של אונטריו. עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה מענקי תגלית ל- SKW (מענק #304737) ו- LS (מענק #401127).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin | HyClone | SH30042.02 | |
1 mL Slip-Tip Syringe | BD | 309659 | |
10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 302995 | |
10% Povidone Iodine Solution | LORIS | 109-08 | |
15 mL Conical Tubes | Thermo-Fisher | 14955240 | |
18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle | BD | 305196 | |
25 G x 5/8 in Needle | BD | 305122 | |
2-Mercaptoethanol | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 | BioRad | 1610158 | |
4% Paraformaldehyde-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
5 mL Luer-Lok Syringe | BD | 309646 | |
96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom | Greiner Bio One | 655180 | |
Acetic Acid, Glacial | Thermo-Fisher | A38-212 | |
Agarose | Froggabio | A87-500G | |
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse | Invitrogen | A11001 | |
Allegra X-14 Centrifuge | Beckman Coulter | B08861 | |
Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
Bleach (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
Broad, unserrated tipped forceps | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
Centramate Cassette Holder | PALL | CM018V | |
ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
CO2 Incubator | Thermo-Fisher | ||
Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
DF1 Cells | ATCC | CRL-12203 | |
Diet Gel Recovery | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
Digital 1502 Sportsman Egg Incubator | Berry Hill | 1502W | |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
Egg Candler | Berry Hill | A46 | |
Ethanol (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 | |
Fine Point High Precision Forceps | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
Fluorescent Microscope | ZEISS AXIO | Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein | |
Freeze Dry System Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
GiBOX Gel Imager | Syngene | Imaging of Agarose Gels | |
Glycerol | Thermo-Fisher | G33-1 | |
Glycine | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Thermo-Fisher | 4368814 | |
High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium | Cytiva | SH30022.01 | |
Humidity Kit | Berry Hill | 3030 | |
Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile) |
L-Lysine Monohydrochloride | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | RK-07522-20 | Peristaltic Pump with digital display |
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Platinum-Cured Silicone |
MC Pro 5 Thermocycler | Eppendorf | EP950040025 | |
Methanol | Thermo-Fisher | A412-4 | |
Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE cast and running appartus |
Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Clone 6H12 |
Normal Goat Serum | Abcam | AB7481 | |
NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K | PALL | OS100T02 | |
Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System | Thermo-Fisher | B1A | |
PBS 10X Solution | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
PowePac 300 | BioRad | Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis | |
Q5 High Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
QIA Amp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
Sodium Hydroxide (Pellets) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
Specific pathogen free eggs | CFIA | NA | Supplier will vary depending on location |
Sucrose | Thermo-Fisher | S5-3 | |
Supracap 50 Depth Filter | PALL | SC050V100P | |
Surgical Scissors | Thermo-Fisher | 08-951-5 | |
Sw41Ti Rotor | Beckman Coulter | 331362 | Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 |
SX4750 Rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes | Beckman Coulter | 359472 | |
TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) | Beckman Coulter | 344059 | |
Tris Base | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
Tubing Screw Clamp | PALL | 88216 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
Utility Pressure Gauges | Cole-Parmer | 68355-06 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved