Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מספקים הליך מפורט לייצור, טיהור וכימות של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה. פרוטוקול זה מניב באופן עקבי > 6 × 109 יחידות יוצרות פלאק/מ"ל, ומספק כמויות נגיפיות המתאימות למחקרים בבעלי חיים in vivo . מתוארים מבחני בקרת איכות נוספים להבטחת בטיחות in vivo .

Abstract

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), הידוע גם בשם אורתובולה עופות serotype-1, הוא נגיף RNA חד-גדילי בעל חוש שלילי שפותח הן כנגיף אונקוליטי והן כחיסון בעל וקטור נגיפי. NDV הוא סוכן טיפולי ומניעה אטרקטיבי בשל מערכת הגנטיקה ההפוכה המבוססת היטב שלו, תכונות אימונוסטימולטוריות חזקות ופרופיל בטיחות מעולה. כאשר הוא ניתן כנגיף אונקוליטי או כחיסון בעל וקטור נגיפי, NDV מעורר תגובה חיסונית חזקה של אנטיטומור או אנטיגן ספציפי, ומפעיל הן את הזרוע המולדת והן את הזרוע הנרכשת של מערכת החיסון.

בהתחשב במאפיינים רצויים אלה, NDV הוערך בניסויים קליניים רבים והוא אחד הנגיפים האונקוליטיים הנחקרים ביותר. נכון לעכשיו, ישנם שני ניסויים קליניים רשומים הכוללים NDV: אחד המעריך חיסון רקומביננטי בעל וקטור NDV עבור SARS-CoV-2 (NCT04871737), והשני מעריך קידוד NDV רקומביננטי אינטרלוקין-12 בשילוב עם Durvalumab, נוגדן antiPD-L1 (NCT04613492). כדי להקל על התקדמות נוספת של הווקטור הנגיפי המבטיח ביותר הזה, יש צורך בשיטות פשוטות ליצירת NDV רקומביננטי (rNDV) ברמה גבוהה, בדרגה in vivo.

מאמר זה מתאר הליך מפורט להגברת rNDV בביצי עוף עובריות ללא פתוגנים (SPF) וטיהור rNDV מנוזל אלנטואי, עם שיפורים להפחתת האובדן במהלך הטיהור. כמו כן נכללים תיאורים של מבחני בקרת האיכות המומלצים, אשר יש לבצע כדי לאשר חוסר מזהמים ושלמות הנגיף. באופן כללי, הליך מפורט זה מאפשר סינתזה, טיהור ואחסון של NDV ברמה גבוהה, בדרגה in vivo, רקומביננטית, לנטוגנית ומזוזנית לשימוש במחקרים פרה-קליניים.

Introduction

נגיף מחלת ניוקאסל, הידוע גם בשם Avian Orthoavulavirus-1, הוא עטוף פרמיקסווירוס עופות בעל פוטנציאל לשמש הן כנגיף אונקוליטי והן כחיסון בעל וקטור נגיפי 1,2,3,4,4,5,6,7. לאחרונה, NDV שתוכנן לבטא את חלבון הספייק של SARS-CoV-2 אופיין כחיסון תוך-ורידי יעיל במודלים של אתגר עכברים ואוגרים 7,8,9. כאשר משתמשים בה כאימונותרפיה של סרטן, היא גורמת לגיוס של תאי....

Protocol

כל העבודות הכרוכות בשימוש בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת גואלף בהתאם למועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים. כל העבודות מבוצעות במעבדה BioSafety Level 2 (BSL2) בקנדה שבה NDV מזוגני הוא פתוגן מקבוצת סיכון 2. כל השלבים הכרוכים בהגברה וטיהור של NDV צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי מסוג IIA למטרות בטיחות ועקרות.

1. הגברה של NDV באמצעות ביצי תרנגולת עובריות מוגדרות ללא פתוגנים

  1. חיסון ביצי עוף עובריות SPF
    הערה: בדרך כלל, שמונה תריסר ביצי עוף עובריות SPF משמשות ליצירת אצווה אחת בדרגה in vivo של NDV. הזמינו תריסר או שניים של ביצים נוספות כדי להסביר את הנזק במהלך המשלוח, כמו גם את השונ....

Representative Results

קצירת נוזל אלנטואי
מכיוון שנוזל אלנטואי נקטף מביצי תרנגולת עובריות, הוא צריך להיראות ברור ושקוף. אם הנוזל נראה אטום וצהוב, הדבר מצביע על נוכחות של מזהמים. הכללת נוזל אלנטואי זה במהלך הטיהור תעכב את תהליך הטיהור, שכן הלחץ יעלה במהירות ויעלה על 10 psi, וכתוצאה מכך גזירה של הנגיף ואובד.......

Discussion

וירוסים המשמשים כחומרים טיפוליים במחקרים פרה-קליניים חייבים להיות מטוהרים מאוד כדי למנוע רעילות כאשר הם ניתנים in vivo15. אם סוכנים הרפתקנים או מזהמים אינם מוסרים, זה יכול להוביל לתגובות שליליות חמורות השוללות את ההשפעה הטיפולית של הסוכן הנגיפי28. מכיוון ש-NDV מי?.......

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

J.G.E.Y זכה במלגת דוקטורט של הקולג' הווטרינרי של אונטריו ובמלגת בוגרים של אונטריו. עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה מענקי תגלית ל- SKW (מענק #304737) ו- LS (מענק #401127).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% TrypsinHyCloneSH30042.02
1 mL Slip-Tip SyringeBD309659
10 mL Luer-Lok SyringeBD302995
10% Povidone Iodine SolutionLORIS109-08
15 mL Conical TubesThermo-Fisher14955240
18G x 1 1/2 in Blunt Fill NeedleBD305180
18G x 1 1/2 in Precision Glide NeedleBD305196
25 G x 5/8 in NeedleBD305122
2-MercaptoethanolThermo-Fisher03446I-100
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1BioRad1610158
4% Paraformaldehyde-PBSThermo-FisherJ19943-K2
5 mL Luer-Lok SyringeBD309646
96 Well Tissue Culture Plate - Flat BottomGreiner Bio One655180
Acetic Acid, GlacialThermo-FisherA38-212
AgaroseFroggabioA87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-MouseInvitrogenA11001
Allegra X-14 CentrifugeBeckman CoulterB08861
Ammonium PersulfateBioRad161-0700
Bleach (5%)Thermo-Fisher36-102-0599
Broad, unserrated tipped forcepsThermo-Fisher09-753-50
Bromophenol BlueSigma-Aldrich114405-25G
Centramate Cassette HolderPALLCM018V
ChemiDoc XRS+BioRad1708265
CO2 IncubatorThermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259Thermo-FisherBP101-50
DF1 CellsATCCCRL-12203
Diet Gel RecoveryClearH2O, INC72-01-1062
Digital 1502 Sportsman Egg IncubatorBerry Hill1502W
D-MannitolSigma-AldrichM4125-500G
Egg CandlerBerry HillA46
Ethanol (70%)Thermo-FisherBP82031GAL
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2OThermo-FisherBP2482-500
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F)Cole-Parmer06349-50
Fetal Bovine SerumGibco12483-020
Fine Point High Precision ForcepsThermo-Fisher22-327379
Fluorescent MicroscopeZEISS AXIONot necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein
Freeze Dry System Freezone 4.5LABCONCO
GiBOX Gel ImagerSyngeneImaging of Agarose Gels
GlycerolThermo-FisherG33-1
GlycineThermo-FisherBP381-5
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase KitThermo-Fisher4368814
High Glucose Dulbecco's Modified Essential MediumCytivaSH30022.01
Humidity KitBerry Hill3030
IodixanolSigma-AldrichD155660% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)
L-Lysine MonohydrochlorideSigma-Aldrich62929-100G-F
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPTCole-Parmer41507-44
Masterflex L/S Digital DriveCole-ParmerRK-07522-20Peristaltic Pump with digital display
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision TubingCole-ParmerRK-07514-10
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16Cole-Parmer96420-16BioPharm Platinum-Cured Silicone
MC Pro 5 ThermocyclerEppendorfEP950040025
MethanolThermo-FisherA412-4
Mini Protean Tetra CellBioRad1658000EDUSDS-PAGE cast and running appartus
Mouse-Anti-NDVNovus BiologicalsNBP2-11633Clone 6H12
Normal Goat SerumAbcamAB7481
NP-40Thermo-Fisher85124
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100KPALLOS100T02
Optima XE-90 UltracentrifugeBeckman CoulterA94471
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis SystemThermo-FisherB1A
PBS 10X SolutionThermo-FisherBP399-20
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000Sigma-Aldrich81300-1KG
PowePac 300BioRadModel 1655050 - for Agarose gel electrophoresis
Q5 High Fidelity 2X Master MixNew England BiolabsM0492S
QIA Amp Viral RNA Mini KitQiagen52904
RedSafeThermo-Fisher50999562
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mLThermo-Fisher66380
Sodium Dodecyl SulfateThermo-FisherBP166-500
Sodium Hydroxide (Pellets)Thermo-FisherS318-10
Specific pathogen free eggsCFIANASupplier will vary depending on location
SucroseThermo-FisherS5-3
Supracap 50 Depth FilterPALLSC050V100P
Surgical ScissorsThermo-Fisher08-951-5
Sw41Ti RotorBeckman Coulter331362Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750 RotorBeckman Coulter369702
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom TubesBeckman Coulter359472
TEMEDInvitrogen15524-010
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in)Beckman Coulter344059
Tris BaseThermo-FisherBP152-5
Tubing Screw ClampPALL88216
Tween 20Sigma-AldrichP1379-1L
Utility Pressure GaugesCole-Parmer68355-06

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved