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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per ricostituire i fasci di microtubuli in vitro e quantificare direttamente le forze esercitate al loro interno utilizzando l'intrappolamento ottico simultaneo e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Questo test consente la misurazione su scala nanometrica delle forze e degli spostamenti generati dagli insiemi proteici all'interno delle reti di microtubuli attivi.

Abstract

Le reti di microtubuli sono impiegate nelle cellule per svolgere una vasta gamma di compiti, che vanno dall'agire come tracce per il trasporto delle vescicole al lavoro come array specializzati durante la mitosi per regolare la segregazione cromosomica. Le proteine che interagiscono con i microtubuli includono motori come chinesine e dineina, che possono generare forze attive e movimento direzionale, nonché proteine non motorie che reticolano i filamenti in reti di ordine superiore o regolano la dinamica dei filamenti. Ad oggi, gli studi biofisici sulle proteine associate ai microtubuli si sono concentrati in modo schiacciante sul ruolo delle singole proteine motorie necessarie per il trasporto delle vescicole e sono stati compiuti progressi significativi nel chiarire le proprietà generatrici di forza e la regolazione meccanochimica delle chinesine e delle dineine. Tuttavia, per i processi in cui i microtubuli agiscono sia come carico che come traccia, come durante lo scorrimento del filamento all'interno del fuso mitotico, si capisce molto meno sulla regolazione biofisica degli insiemi delle proteine reticolanti coinvolte. Qui, descriviamo in dettaglio la nostra metodologia per sondare direttamente la generazione e la risposta della forza all'interno di reti minime di microtubuli reticolati ricostituiti da microtubuli purificati e proteine mitotiche. Le coppie di microtubuli sono reticolate da proteine di interesse, un microtubulo è immobilizzato su un vetrino di copertura del microscopio e il secondo microtubulo è manipolato da una trappola ottica. La microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale simultanea consente la visualizzazione multicanale di tutti i componenti di questa rete di microtubuli mentre i filamenti si allontanano per generare forza. Dimostriamo anche come queste tecniche possono essere utilizzate per sondare le forze di spinta esercitate dagli insiemi di kinesina-5 e come le forze di frenata viscosa si verificano tra coppie di microtubuli scorrevoli reticolate dal mitotico MAP PRC1. Questi saggi forniscono approfondimenti sui meccanismi di assemblaggio e funzione del fuso e possono essere più ampiamente adattati per studiare la meccanica delle reti di microtubuli densi in diversi contesti, come l'assone e i dendriti dei neuroni e delle cellule epiteliali polari.

Introduzione

Le cellule impiegano reti di microtubuli per eseguire un'ampia varietà di compiti meccanici, che vanno dal trasporto delle vescicole 1,2,3 alla segregazione cromosomica durante la mitosi 4,5,6. Molte delle proteine che interagiscono con i microtubuli, come le proteine molecolari kinesina e dineina, generano forze e sono regolate da carichi meccanici. Per capire meglio come funzionano queste molecole critiche, i ricercatori hanno impiegato metodi biofisici a singola molecola, come l'intrappolamento ottico e la microscopia TIRF, per monitorare direttamente parametri critici come i tassi di passo scaricati, la processività e le relazioni forza-velocità per le singole proteine. La geometria sperimentale più comunemente usata è stata quella di attaccare le proteine motorie direttamente alle perle di intrappolamento la cui geometria sferica e le cui dimensioni imitano le vescicole sottoposte a trasporto motorizzato. Numerose chinesine, tra cui kinesin-1 7,8,9, kinesin-2 10,11,12, kinesin-3 13,14,15,16 kinesin-517,18, kinesin-8 19,20, nonché complessi dynein e dynein 21,22, 23,24,25, sono stati studiati con questi metodi.

In molti processi cellulari, tuttavia, le proteine motorie e non motorie utilizzano microtubuli sia come traccia che come carico26,27. Inoltre, in questi scenari in cui i filamenti di microtubuli sono reticolati in fasci di ordine superiore, queste proteine funzionano come insiemi piuttosto che singole unità. Ad esempio, all'interno delle cellule somatiche in divisione, dense reti di filamenti si auto-organizzano per costruire l'apparato del fuso mitotico28,29,30. La rete di microtubuli del fuso interpolare è altamente dinamica ed è in gran parte organizzata con estremità inferiori che puntano verso i poli del fuso e estremità superiori che si sovrappongono vicino all'equatore del mandrino. I filamenti all'interno del fuso sono reticolati da proteine motorie come la chinesina-5 31,32,33, la chinesina-12 34,35,36 e la chinesina-1437,38,39, o da proteine non motorie come PRC1 40,41,42,43 o NuMA 44,45, 46. Spesso si muovono o subiscono stress meccanici durante processi come il flusso verso i poli o mentre coordinano la centratura cromosomica durante la metafase o la segregazione cromosomica durante l'anafase 47,48,49,50,51,52. L'integrità dell'apparato del fuso su scala micron attraverso la mitosi, quindi, si basa su un equilibrio attentamente regolato di forze di spinta e trazione generate e sostenute da questa rete di filamenti interagenti. Tuttavia, gli strumenti necessari per sondare questa regolazione meccanica e spiegare come gli insiemi proteici lavorano di concerto per coordinare i movimenti dei microtubuli e produrre le forze necessarie per assemblare correttamente il mandrino sono stati sviluppati solo di recente, e stiamo appena iniziando a capire le regole biofisiche che definiscono le reti dinamiche di microtubuli.

L'obiettivo di questo manoscritto è dimostrare i passaggi necessari per ricostituire coppie di microtubuli reticolati in vitro, immobilizzare questi fasci in una camera di microscopia che consenta la visualizzazione simultanea della fluorescenza sia dei microtubuli che delle proteine reticolanti e la misurazione della forza su scala nanometrica ed elaborare questi dati in modo robusto. Descriviamo in dettaglio i passaggi necessari per polimerizzare stabilmente microtubuli marcati con fluorescenza, preparare i vetrini di copertura del microscopio per il fissaggio, preparare perle di polistirolo per esperimenti di intrappolamento ottico e assemblare reti di filamenti reticolati che preservano la loro funzionalità in vivo consentendo al contempo la manipolazione biofisica diretta.

Protocollo

1. Preparazione di microtubuli

NOTA: Quando si utilizzano proteine reticolanti marcate con GFP, l'etichettatura dei fluorofori organici rossi (ad esempio, rodamina) e rosso lontano (ad esempio, HiLyte647 biotinilato, indicato come rosso lontano biotinilato nel resto del testo) l'etichettatura dei fluorofori organici dei microtubuli funziona bene. La diafonia minima tra tutti e tre i canali può essere ottenuta durante l'imaging utilizzando un filtro a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) quad band di alta qualità.

  1. Preparare le scorte di semi di microtubuli GMPCPP
    1. Sospendere 1 mg di tubulina liofilizzata non marcata in 84 μL di 1x BRB80 ghiacciato (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA; pH 6,8), con DTT aggiunto a una concentrazione finale di 1 mM appena prima dell'uso. Sospendere 60 μg di tubulina liofilizzata marcata con fluorofori in 6 μL di freddo 1x BRB80 con 1 mM DTT. Sospendere 60 μg di tubulina liofilizzata marcata con biotina in 6 μL di freddo 1x BRB80 con 1 mM DTT.
    2. Per preparare uno stock di semi di tubulina marcati con rodamina non biotinilata con un rapporto di etichettatura di 1:10, aggiungere 84 μL di tubulina non marcata, 6 μL di tubulina marcata con fluoroforo e 10 μL di 10 mM di soluzione madre GMPCPP a un tubo da 0,5 ml. Mescolare bene pipettando delicatamente e mantenere in ghiaccio.
      NOTA: La polimerizzazione GMPCPP è preferita per questi saggi in quanto i microtubuli sono più stabili e suscettibili di manipolazione diretta con la trappola ottica rispetto a se polimerizzati con GTP o se il taxolo viene omesso.
    3. Per preparare semi di tubulina biotinilati marcati in rosso con un rapporto di etichettatura fluorescente di 1:10, aggiungere 80 μL di tubulina non marcata, 6 μL di tubulina marcata con fluoroforo, 4 μL di tubulina marcata con biotina e 10 μL di soluzione madre GMPCPP da 10 mM in un tubo da 0,5 ml. Mescolare bene pipettando delicatamente e mantenere in ghiaccio. Incubare il ceppo di semi sul ghiaccio per 5 minuti.
    4. Trasferire la soluzione di tubulina in un tubo di policarbonato adatto per la centrifugazione ad alta velocità. Centrifugare il ceppo del seme a ~350.000 x g per 5 minuti a 2 °C per prevenire la polimerizzazione dei microtubuli e recuperare il surnatante per l'aliquotazione. La concentrazione finale stimata di tubulina in questa fase è ~ 50 μM.
    5. Utilizzando provette PCR da 0,2 ml, preparare 2 μL di aliquote del ceppo di seme e congelare istantaneamente con azoto liquido. Le aliquote possono essere conservate a -80 °C per un massimo di 6 mesi.
  2. Polimerizzazione di microtubuli
    1. Preparare 500 μL di 1x BRB80 e mettere su ghiaccio. Mettere una ciascuna delle aliquote di semi di rodamina biotinilati rosso e non biotinilato sul ghiaccio per scongelare.
    2. Incubare i ceppi di semi sul ghiaccio per 5 minuti. Alla fine del periodo di incubazione, aggiungere immediatamente 26 μL di 1x BRB80 a ciascun tubo. Se si desiderano microtubuli più lunghi, aumentare il volume di BRB80 di 5-10 μL, mentre, per i microtubuli più corti, ridurre il volume per la polimerizzazione di 5 μL.
    3. Incubare i ceppi di semi di microtubuli per 1 ora a 37 °C a bagnomaria. Combinare 298,5 μL di temperatura ambiente 1x BRB80 e 1,5 μL di 4 mM di taxolo soluzione madre per produrre una soluzione di taxolo da 20 μM. Preparare 300 μL di 1x BRB80 e mantenere entrambi i tubi a temperatura ambiente.
    4. Riscaldare un rotore ad alta velocità appropriato a 30 °C. Questo può essere fatto in un'ultracentrifuga da tavolo impostata a 30 °C. Rimuovere i microtubuli dal bagnomaria e tenerli a temperatura ambiente su un banco per 10-15 minuti.
  3. Chiarificazione dei microtubuli
    1. Aggiungere 100 μL di temperatura ambiente 1x BRB80 alla soluzione di crescita dei microtubuli e mescolare facendo scorrere il tubo ~ 10 volte o pipettando delicatamente. Trasferire la soluzione di crescita dei microtubuli in una provetta da centrifuga in policarbonato.
    2. Segnare un lato del tubo in policarbonato, che sarà rivolto verso l'esterno rispetto alla rotazione della centrifuga. Ciò aiuterà a localizzare il pellet di microtubuli, che sarà appena visibile a causa del piccolo volume di materiale.
    3. Centrifugare la soluzione di microtubuli a ~350.000 x g per 10 minuti a 30 °C. Dopo la centrifugazione, ispezionare il tubo contenente i microtubuli per un pellet, se possibile. Rimuovere con cura tutti tranne gli ultimi microlitri di liquido, senza disturbare il pellet. Se il pellet non è chiaramente visibile, utilizzare la marcatura fatta come guida per evitare di disturbare l'area in cui si trova il pellet.
    4. Aggiungere immediatamente 100 μL di 1x BRB80 + 20 μM taxolo al tubo microtubulo. Questo può essere aggiunto direttamente sul pellet; L'interruzione del pellet in questa fase non influisce in modo significativo sul processo di chiarificazione.
    5. Centrifugare nuovamente i microtubuli a ~350.000 x g per 10 minuti, facendo attenzione ad assicurarsi che la sezione marcata del tubo sia nuovamente orientata verso l'esterno rispetto alla rotazione della centrifuga.
    6. Rimuovere tutti tranne pochi microlitri di soluzione come prima, facendo attenzione a evitare di interrompere il pellet di microtubuli. Ripetere i passaggi 1.3.4.-1.3.5. e quindi risospendere il pellet di microtubuli in 20-50 μL di 1x BRB80 + 20 μM taxolo.
    7. Risospendere pipettando la maggior parte del volume di risospensione ed espellendolo delicatamente direttamente sul pellet, ripetendo 20-30x o fino a quando il pellet non è completamente sospeso. Questo dovrebbe essere fatto con cura in modo da non tagliare i microtubuli con pipettaggio eccessivamente vigoroso. Anche il taglio della punta della pipetta per aumentare le dimensioni dell'apertura può essere utile per ridurre la cesoiatura dei microtubuli.
    8. Conservare i microtubuli a temperatura ambiente avvolgendo il tubo in un foglio per proteggere i fluorofori dalla luce e tenendoli sul piano di lavoro. I microtubuli sono generalmente utilizzabili per 2-3 giorni dopo la chiarificazione.
  4. Valutazione dei microtubuli mediante microscopia
    1. Preparare una diluizione 1:10 della soluzione di microtubuli chiarificata mescolando 1 μL di microtubuli e 9 μL di temperatura ambiente 1x BRB80. Visualizzare immediatamente questa soluzione pipettando 10 μL su un vetrino da microscopio e quindi posizionando un coprislip sopra la goccia per formare una zucca.
    2. Assicurarsi che i microtubuli di lunghezza compresa tra 8 e 25 μm ad alta densità (diverse centinaia per campo visivo completo stratificato in una fitta rete) siano visibili quando visualizzati utilizzando la microscopia a fluorescenza e un obiettivo 100x focalizzato sulla superficie del coprivetrino a contatto con la diluizione del microtubulo.

2. Preparazione dei vetrini passivati

  1. Lavaggio, coprivetrine
    1. Posizionare i coprivetrini da 18 x 18 mm in rack di plastica non reattivi, quindi posizionare ciascun rack in un becher da 100 ml. Posizionare un coprislip per fessura nei rack, poiché è necessaria la pulizia di entrambi i lati dei coprivetrini.
    2. Sonicare utilizzando un sonicatore da bagno per 5 minuti, utilizzando 50 ml delle seguenti soluzioni nell'ordine indicato per ciascun ciclo di sonicazione: (1) acqua deionizzata (con resistività di 18,3 MΩ-cm), (2) soluzione Micro-90 al 2%, (3) acqua deionizzata, (4) 0,1 M KOH appena preparata, (5) acqua deionizzata (Figura 1A). Assicurarsi che i vetrini siano completamente coperti di liquido. Tra i cicli di sonicazione, sciacquare ogni rack di coperchi in acqua deionizzata utilizzando una pinzetta per immergere il rack su e giù 10-20x in acqua deionizzata, sostituire l'acqua e ripetere il processo di risciacquo 2x.
    3. Risciacquare i coperchi 3 volte in acqua, quindi riempire nuovamente i becher con etanolo al 100% e riportare i rack ai bicchieri. Spostare i becher in una cappa aspirante e disporre abbastanza salviette di tessuto per fare spazio a tutti i rack di copertura. Quindi, rimuovere i rack con una pinzetta e posizionare sulle salviette di tessuto.
    4. Utilizzando un flusso di azoto gassoso secco, soffiare via l'etanolo dai coperchi e dai loro rack fino a quando non sono asciutti. Smaltire l'etanolo rimanente dai becher e asciugarli similmente utilizzando il flusso di azoto gassoso secco (Figura 1A).
  2. Funzionalizzazione superficiale aminosilano su vetrini
    1. Preparare la soluzione di reagente (3-Aminopropil)tiethoxysilane (APTES) aggiungendo 40 mL di acetone e 400 μL di reagente APTES in un tubo conico da 50 ml, tappando ermeticamente e mescolando invertendo 10x.
    2. Spostare un rack di coperchi nel becher asciutto corrispondente, quindi immergerlo completamente nella soluzione APTES. Incubare per 5 minuti (Figura 1A). Spostare il rack trattato APTES in un nuovo becher asciutto e spostare un nuovo rack nell'APTES per incubare per 5 m.
    3. Risciacquare il rack trattato con acqua deionizzata immergendo il rack 10-20x come descritto al punto 2.1.2., sostituendo l'acqua 5x. Ripetere l'operazione fino a quando tutti i vetrini sono stati trattati e lavati.
  3. PEGilazione della superficie aminosilana
    1. Preparare due soluzioni PEG, una di ~100 μL con 25% p/v PEG e un'altra di ~10 μL con 10% p/v di biotina-PEG, entrambe sospese in 0,1 M NaHCO3 appena preparato, sufficienti a rivestire 24 vetrini. Centrifugare la soluzione di PEG al 25% a 3.000 x g per 20 s una volta aggiunto 0,1 M NaHCO3 per sciogliere completamente il PEG; La soluzione potrebbe rimanere torbida. Mescolare il biotina-PEG mediante pipettaggio delicato (Figura 1B).
    2. Preparare una miscela delle soluzioni PEG e biotina-PEG, con 33,3 volte il volume di PEG a 1 volume di biotina-PEG (ad esempio, 100 μL di soluzione PEG e 3 μL di soluzione di biotina-PEG).
    3. In una cappa aspirante, stendere diverse salviette sterili e prive di lanugine. Spostare i portapacchi sulle salviette e asciugare con un flusso di azoto gassoso secco come prima. Su diverse salviette nuove e asciutte, disporre le copertine ora completamente asciutte disposte a coppie ed etichettare ciascuna nell'angolo in basso a destra con un simbolo asimmetrico come "b". Questa marcatura sarà opposta alla superficie del campione del vetrino e non interferirà con l'esperimento (Figura 1B).
    4. Capovolgi una copertina in ogni paio con una pinzetta. Su ciascun vetrino capovolto, posizionare 6 μL di miscela PEG/biotina-PEG e posizionare il secondo vetrino sopra in modo che entrambe le etichette "b" siano rivolte verso l'esterno.
    5. Allineare i bordi del coprislip e posizionarli in una camera umidificata e ermetica per evitare l'asciugatura. Incubare i coprivetrini nella camera di umidità a temperatura ambiente per 3 ore.
    6. Dopo l'incubazione, rimuovere i coprivetrini dalla camera di umidità, separare accuratamente le coppie di coprivetrini e rimetterli nei loro rack. Lavare ogni rack in acqua deionizzata come prima, immergendo i rack usando una pinzetta 10-20x e sostituendo l'acqua per un totale di 5x.
    7. Posizionare tutti i lati PEGilati dei vetrini di copertura rivolti nella stessa direzione in modo che non siano rivolte l'una verso l'altra due superfici PEGilate. La superficie PEGilata sarà molto appiccicosa fino a quando non si asciuga completamente, quindi fai particolare attenzione a evitare che i coprivetrini si tocchino. Asciugare ogni rack e i coprivetrini come prima di utilizzare un flusso di azoto gassoso secco (Figura 1B).
    8. Una volta che i vetrini di copertura e i relativi rack sono completamente asciutti, conservare in un essiccatore sottovuoto per evitare il degrado del rivestimento superficiale. Correttamente conservato sotto vuoto e con essiccante per evitare che l'umidità interrompa il rivestimento PEG; I coprivetrini possono essere utilizzati per circa 1 settimana.

3. Preparazione di perle rivestite di kinesina

  1. Selezione e preparazione del costrutto di rigore kinesina
    1. Esprimere e purificare i costrutti di rigore chinaina secondo i protocolli pubblicati53,54. Congelare istantaneamente 5 μL di aliquote di 0,02 mg/mL di soluzioni di kinesina e conservare a -80 °C per un massimo di 1 anno.
      NOTA: Le proteine della chinesina rigor hanno una mutazione puntiforme G234A che impedisce l'idrolisi dell'ATP. Quando coniugato alle microsfere, le interazioni ad alta affinità con il microtubulo consentono alle perle di sostenere carichi di 10-20 pN per diversi minuti. In questi saggi54 sono state impiegate con successo anche versioni mutate in rigore dell'omodimero kinesin-1 K56053 comunemente impiegato e di un costrutto K439 ulteriormente ottimizzato54. Questo costrutto K439 migliorato contiene un dominio di dimerizzazione EB1 per migliorare la stabilità e un tag C-terminale 6-His per il legame specifico a un anticorpo 6-His come descritto di seguito.
  2. Legame 6-Suo anticorpo alle perle rivestite di streptavidina
    1. Aggiungere 50 μL di perle di polistirene rivestite di streptavidina del diametro di 1 μm in una provetta da centrifuga da 0,5 ml. Sonicare per 30 s.
    2. Aggiungere 10 μL di 200 mM DTT a 790 μL di 1x BRB80. Aggiungi 10 μL di perline sonicate a 40 μL di questo buffer DTT 1x BRB80 + 2,5 mM.
    3. Combinare 1 μL di anticorpo 6-His biotinilato e 49 μL di 1x BRB80 + 2,5 mM DTT; vortice brevemente per mescolare.
    4. Unire i 50 μL di miscela di sfere diluite e 50 μL di diluizione anticorpale in una nuova provetta. Posizionare il tubo in un rotatore tubolare a 4 °C e ruotare per 1 ora. Girare la miscela di perline per 10 minuti a 3.000 x g a 4 °C.
    5. Pipettare il surnatante e risospendere il pellet in 100 μL di soluzione di caseina da 2 mg/ml in 1x BRB80. Ripetere questa centrifugazione e risospensione 2x.
  3. Aggiunta di rigor kinesin
    1. Risospendere il pellet finale in 100 μL di soluzione di caseina da 2 mg/ml. In una provetta da centrifuga da 0,5 ml, unire 5 μL di 0,02 mg/mL di rigor kinesina e 5 μL di perline, mescolando delicatamente facendo scorrere leggermente il tubo ~10x.
    2. Mantenere sia la sospensione del tallone K439 G234A che le restanti perle 6-His sul rotore a 4 °C quando non sono in uso. Le perline devono essere preparate fresche e utilizzate lo stesso giorno per gli esperimenti in quanto tendono ad aggregarsi e perdere attività oltre questo tempo.

4. Assemblaggio della camera di microscopia

  1. Preparazione di vetrini e costruzione della camera
    1. Risciacquare i vetrini del microscopio da 75 mm x 25 mm prima con acqua ultrapura, seguita da un detergente per vetri ammoniaca-d senza striscia e poi ancora una volta con acqua ultrapura. Agitare per rimuovere le goccioline d'acqua in eccesso. Asciugare i vetrini utilizzando un getto di azoto in modo che non rimangano strisce e posare i vetrini su un tovagliolo di carta (Figura 2A).
    2. Con le forbici, tagliare il nastro biadesivo in strisce di ~ 2-3 mm x 2,5 cm (2 strisce per camera singola e 3 per doppia camera).
    3. Usando una pinza, posare due strisce di nastro adesivo su un vetrino in modo che ci sia ~ 0,5 cm di spazio tra di loro per costruire una singola camera. Per le camere doppie, utilizzare la stessa spaziatura, ma con tre strisce di nastro adesivo (Figura 2B). Il volume del canale di campionamento utilizzando questo metodo è di circa 10 μL.
      NOTA: Più ampia è la camera, più è probabile che si formino bolle quando le soluzioni vengono fatte fluire; Tuttavia, le camere larghe meno di 0,5 cm possono essere difficili da usare a causa dell'area ridotta per l'imaging.
    4. Raschiare la lunghezza di ogni striscia di nastro usando una pinza in modo che il nastro aderisca saldamente al vetrino.
    5. Rilasciare la pressione dall'essiccatore e utilizzare una pinza per rimuovere un foglietto di copertura biotinilato da un rack di stoccaggio. Posizionare un coprivetrino biotinilato sopra il vetrino usando una pinza. Assicurarsi che il lato biotinilato sia rivolto verso l'interno, verso il vetrino.
    6. Utilizzando l'estremità posteriore piatta della pinza, premere delicatamente sul vetro dove il coprislip tocca il nastro per sigillare saldamente le camere. Si deve usare una leggera pressione per garantire che il vetrino di copertura non si rompa (figura 2C).
    7. Conservare le camere di microscopia finite in un contenitore ermetico, lontano dalla luce diretta, fino all'uso (Figura 2D).
      NOTA: Si consiglia di utilizzare le camere lo stesso giorno in cui vengono realizzate, poiché i vetrini di copertura biotinilati si degradano se esposti all'aria.
  2. Flusso di reagenti per microscopia
    1. Costruire una camera di umidità posizionando un tessuto privo di lanugine ripiegato inumidito con acqua ultrapura sul fondo di una scatola di punta vuota per pipette. Le camere di campionamento devono essere conservate in questa scatola tra le fasi di flusso in ingresso per ridurre l'evaporazione delle soluzioni dal canale.
    2. Introdurre tutti i reagenti pipettando il liquido a un'estremità del canale e espellendo il liquido all'estremità opposta. Per stoppare, ruotare un'estremità del tessuto e posizionarla delicatamente sul lato di uscita della camera, consentendo un'azione capillare per distribuire omogeneamente il reagente (Figura 3A). Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente appena prima di fluire per prevenire la depolimerizzazione dei microtubuli.
    3. Utilizzando una punta di pipetta angolata da 20 μL in modo che tocchi il lato di entrata di una camera, far fluire lentamente 10 μL di streptavidina o neutravidina 0,5 mg/ml. Utilizzare punte di pipette più piccole e un flusso lento e costante di reagenti per ridurre la probabilità di ottenere bolle nella camera (Figura 3B).
    4. Incubare il vetrino nella camera di umidità per 4 minuti con il lato di copertura della camera rivolto verso il basso. Questo orientamento consentirà agli oggetti più grandi, come microtubuli o perline, di affondare vicino alla superficie PEGilati.
    5. Lavare la camera utilizzando 20 μL di 1x BRB80, utilizzando un fazzoletto privo di lanugine per estrarre i liquidi. Se c'è una perdita presente nella camera, scartare il vetrino e iniziare con un altro; Le piccole bolle che si verificano nella camera non influiscono negativamente sull'imaging.
    6. Ripetere le fasi di flusso, incubazione e lavaggio con 10 μL di soluzione bloccante della caseina 0,5 mg/ml (Figura 3C). Diluire i microtubuli biotinilati rosso lontano ~1:20 e far fluire 10 μL nella camera. Incubare per 5 minuti e lavare la camera con 20 μL di 1x BRB80 (Figura 3D). La densità ottimale di questi microtubuli all'interno di un campo visivo di imaging di 100 μm x 100 μm dovrebbe essere 10-20; e la diluizione in questa fase dovrebbe essere regolata per ottenere questo rapporto di legame superficiale.
    7. Ripetere le fasi di flusso, incubazione e lavaggio con 10 μL di una concentrazione appropriata (tipicamente 1-10 nM) di proteina reticolante o proteina non motoria da studiare (Figura 3E).
    8. Flusso in 10 μL di microtubuli di rodamina diluiti ad una concentrazione simile a quella dei precedenti microtubuli biotinilati di colore rosso lontano. Ripetere i passaggi di incubazione e lavaggio (Figura 3F).
    9. Combinare 1 μL di perline rivestite di chinesina rigorosa e 19 μL di tampone di reazione ottimizzato per l'attività proteica reticolante. Ad esempio, per l'analisi dell'attività della kinesina-5, utilizzare tampone di reazione con 1 mM di interruttore di legame TCEP, 0,2 mg / mL di alfa caseina, 70 mM KCl, sistema di scavenging dell'ossigeno (4,5 mg / mL di glucosio, 350 unità / mL di glucosio ossidasi, 34 unità / mL di catalasi), 1 mM DTT e ATP alla concentrazione desiderata (ad esempio, 1 mM per le condizioni di massima velocità della chinesina) in 1x BRB80 (Figura 3G ). Per l'analisi di proteine non motorie, omettere ATP e variare la concentrazione di KCl per modulare la forza di interazione proteina-microtubulo in questi test.
    10. Sigillare entrambi i bordi della camera con uno smalto trasparente e attendere che lo smalto si asciughi prima di procedere all'imaging (Figura 3H). Una camera costruita con successo non avrà perdite presenti e bolle minime.

5. Imaging di fasci di microtubuli con TIRF a 3 colori

  1. Utilizzare uno strumento microscopio invertito dotato di capacità di imaging TIRF e nel quale è stata costruita una trappola ottica a raggio singolo (Figura 4).
    NOTA: Per gli studi qui descritti, è stato utilizzato un microscopio invertito con una lente obiettivo a olio 100x/NA1.49, modulo TIRF e tre laser a 488 nm, 561 nm e 640 nm rispettivamente per la proteina marcata con GFP, microtubuli marcati con rodamina e microtubuli biotinilati marcati con rosso lontano, rispettivamente.
    1. Aggiungere una goccia di olio ad immersione sul coprivetrino della camera del campione. L'eccesso di olio può danneggiare l'obiettivo del microscopio. Con il lato del coprislip della camera del campione rivolto verso il basso, posizionare il campione da visualizzare sulla piattaforma del microscopio.
    2. Portare lentamente l'obiettivo verso l'alto in modo che ci sia un contatto tra il copricostume e l'obiettivo attraverso l'olio. Regolare l'altezza dell'obiettivo in modo che la superficie del coperchio della camera di campionamento sia a fuoco.
    3. Registrare immagini a fotogramma singolo del campione in tutti e tre i canali. Per gli esperimenti qui, utilizzare 100-200 ms di esposizione come durata ottimale dell'imaging su tutti e tre i canali; Tempi di esposizione più lunghi possono comportare un aumento del fotosbiancamento.
    4. Regolare la potenza del laser per ottenere un buon rapporto segnale-rumore dai campioni, riducendo al minimo il fotosbiancamento nei 2-5 minuti quando viene analizzato il singolo fascio. Per il laser utilizzato qui (Figura 4 e Figura 5), utilizzare una potenza laser di 5 mW per il canale GFP e 3 mW per entrambi i canali dei microtubuli come ottimale.
      NOTA: I fasci assemblati con successo dovrebbero consistere in un microtubulo immobilizzato in superficie nel canale rosso lontano, una regione coestensiva di diversi micron con un significativo segnale della proteina GFP e un microtubulo di rodamina che si sovrappone a queste regioni e quindi si estende a diversi micron di distanza dal fascio (Figura 5B, C e Figura 6 ). L'imaging dal vivo del microtubulo di rodamina dovrebbe rivelare sottili fluttuazioni all'estremità del microtubulo non reticolato, indicando che questo filamento non è attaccato alla superficie o ad altre proteine nella camera.
    5. Osservare la frequenza dei fasci di microtubuli per campo visivo. Per un campione preparato con successo, dovrebbero essere presenti circa 3-4 fasci di microtubuli per campo visivo di 100 μL x 100 μL per camera.

6. Esecuzione di esperimenti di trappola ottica su fasci di microtubuli

  1. Taratura pre-sperimentale delle condizioni
    1. Per eseguire questi esperimenti, utilizzare una trappola ottica a raggio singolo con una rigidità di 0,05-0,1 pN/nm. Incorporare l'ottica di intrappolamento e il fotorivelatore sensibile alla posizione in un microscopio invertito compatibile con TIRF introducendo filtri a passaggio corto appena sotto l'obiettivo e sopra il condensatore, rispettivamente (Figura 4).
    2. Inoltre, aggiungere uno stadio di nanoposizionamento su cui si trova il campione per consentire all'utente di spostare i microtubuli con precisione su scala nanometrica in modo controllato durante questi test. Il sistema utilizzato qui per acquisire dati rappresentativi è stato descritto nel lavoro pubblicato 27,53,54,56,57.
      NOTA: Sebbene al di là dello scopo di questo protocollo, sono disponibili più risorse che descrivono in dettaglio la costruzione e la calibrazione di una trappola ottica a raggio singolo58,59,60.
    3. Osservare la densità delle perle nel campione utilizzando un canale a campo chiaro o DIC e l'obiettivo 100x sul microscopio. Utilizzare la microscopia a campo chiaro solo per identificare e manipolare le perle e non per registrare simultaneamente con l'acquisizione di immagini a fluorescenza. Distanziare le perle in modo che siano in media a almeno 10 μm l'una dall'altra e assicurarsi che siano libere da qualsiasi tipo di confinamento superficiale o attaccamento e non siano attaccate l'una all'altra o altrimenti raggruppate.
    4. Assicurarsi che i microtubuli biotinilati rosso lontano siano saldamente attaccati alla superficie del vetrino, senza alcun movimento browniano visibile, come movimenti lungo l'asse dei microtubuli o estremità libere di microtubuli fluttuanti in soluzione.
    5. Assicurarsi che i microtubuli di rodamina siano attaccati ai microtubuli biotinilati tramite il MAP reticolante e siano visibilmente fluttuanti alle loro estremità libere. L'attacco superficiale di microtubuli non biotinilati spesso indica che la PEGilazione potrebbe non aver avuto successo o che il rivestimento PEG si è degradato.
  2. Misure di scorrimento dei microtubuli motore-azionamento
    1. Esprimere e purificare la proteina motrice di interesse seguendo protocolli pubblicati. Ad esempio, le proteine kinesina-5 marcate con GFP a lunghezza intera sono state purificate con successo e impiegate in questi test 53,61, così come la kinesina-1262 e la chinesina-1463 non marcate. Assemblare e visualizzare i fasci reticolati motore-proteina come descritto sopra nei passaggi 4 e 5.
    2. Cattura con la trappola ottica una singola perla libera in soluzione che mostra il moto browniano. Regolare l'ottica della trappola secondo necessità per spostare il tallone al centro del campo visivo. Assicurarsi che il modello di interferenza riflessa dal fascio di trappola sia simmetrico e regolare l'ottica dell'abbondanza per risolvere eventuali asimmetrie del fascio.
    3. Spostare lo stadio del campione in modo che l'estremità libera di un microtubulo di rodamina all'interno di un fascio sia direttamente sotto il tallone e il tallone sia a diversi micron di distanza dalla regione di sovrapposizione contenente proteine reticolanti per ridurre al minimo il fotosbiancamento indotto dal fascio di trappola. Abbassare il tallone sull'asse Z fino a quando non si scontra con il microtubulo. Fare attenzione ad abbassare delicatamente il tallone e non spingere il tallone contro la superficie del coprifoglio, poiché ciò potrebbe causare l'adesione alla superficie del coprifoglio.
    4. Spegnere brevemente la trappola per osservare con il canale a campo chiaro la motilità del tallone attaccato al microtubulo scorrevole. Quando si eseguono saggi di proteine motorie, il tallone attaccato si muoverà direzionalmente mentre i microtubuli si allontanano. Riattiva la trappola e cattura di nuovo la perlina.
    5. Iniziare a registrare i dati di fluorescenza nei tre canali (488 nm, 561 nm, 640 nm) a una velocità di 1-2 fotogrammi per s utilizzando la potenza del laser e i tempi di esposizione ottimizzati nel passaggio 5 precedente.
    6. Utilizzando il software del computer di trapping, registrare i dati di tensione dal fotorivelatore sensibile alla posizione (segnali di intensità X, Y e SUM), dallo stadio di nanoposizionamento (coordinate X, Y e Z) e dallo stato dell'otturatore della fotocamera TIRF. Iniziare a digitalizzare questi valori di tensione di trappola utilizzando una scheda di acquisizione dati di ingresso di tensione dedicata controllata da software appropriato (come codice LabView personalizzato) a una velocità di 1-10 kHz, a seconda dei requisiti sperimentali.
    7. Monitorare il segnale di forza man mano che i dati vengono acquisiti e prestare molta attenzione a eventuali anomalie che potrebbero interferire con la corretta raccolta dei dati.
      NOTA: Le anomalie includono ma non sono limitate a (1) altre perle che si muovono nella trappola, (2) la perlina che fuoriesce prematuramente dalla trappola e (3) improvvisi precipitamenti di forza e conseguente incapacità di riavviare la forza contro la trappola, indicando problemi con le molecole di rigore kinesina sulla superficie del tallone.
    8. Dopo la misurazione, disattivare la trappola per rilasciare il tallone e ripetere con una nuova perlina e un nuovo microtubulo fino a raggiungere il numero richiesto di ripetizioni sperimentali.
  3. Misure di resistenza passiva di reticolazione
    1. Esprimere e purificare le proteine reticolanti non motorie di interesse seguendo protocolli pubblicati. Ad esempio, PRC1 43,54,57 marcato con GFP a lunghezza intera e un costrutto troncato NuMA 56 sono stati impiegati con successo in questi test. Assemblare e visualizzare i fasci reticolati come descritto sopra nei passaggi 4 e 5.
    2. Identificare un fascio di microtubuli adatto che contenga solo due microtubuli, uno biotinilato con attacco a superficie completa e un microtubulo non biotinilato parzialmente libero in soluzione; questo dà un'estremità libera per attaccare una perlina e garantisce che la perla non sia attaccata al microtubulo legato alla superficie e sia allineata sull'asse X o Y, in modo tale che il movimento dello stadio sia lungo un solo asse.
    3. Usa la trappola ottica per catturare una perla libera sottoposta a movimento browniano. Una volta che il tallone è stato intrappolato, spostare con attenzione il tallone sul fascio di microtubuli selezionato, assicurandosi che nessun'altra perla venga tirata nella trappola nel processo. Assicurarsi che il tallone sia a diversi micron di distanza dalla regione di sovrapposizione contenente proteine reticolanti per ridurre al minimo il fotosbiancamento del tag GFP.
    4. Abbassare con attenzione il tallone sull'asse Z fino a quando non entra in contatto con il bordo del segmento libero del microtubulo di rodamina. Tirare delicatamente verso l'alto e spostarsi perpendicolarmente all'asse dei microtubuli per verificare la presenza di attaccamenti osservando la flessione del microtubulo di rodamina e seguendo la posizione del tallone. Se non è attaccato, ripetere il leggero urto del tallone sul microtubulo fino a quando non viene attaccato.
    5. Riallineare con attenzione il microtubulo di rodamina lungo l'asse dei microtubuli del microtubulo attaccato alla superficie spostando lo stadio di nanoposizionamento e impostare i parametri per l'estrazione automatica del fascio di microtubuli. Impostare la direzione lungo l'asse parallelo dei microtubuli, impostare la velocità di trazione desiderata (25-200 nm / s è un intervallo utile di velocità) e il tempo di trazione desiderato (circa 30 s a 2 min) a seconda della lunghezza di sovrapposizione.
    6. Iniziare a registrare i dati di fluorescenza nei tre canali (488 nm, 561 nm, 640 nm) a una velocità di 1-2 fotogrammi al secondo. Utilizzare le potenze del laser e i tempi di esposizione ottimizzati nel passaggio 5 sopra.
    7. Avvia il movimento automatico dello stage e registra i dati di abbondanza dal rilevatore sensibile alla posizione, dallo stadio e dallo stato della telecamera TIRF. Monitorare eventuali fattori che potrebbero interferire con la raccolta dei dati, che includono ma non sono limitati a (1) un'altra perla che entra nella trappola, (2) perdita prematura della reticolazione dei microtubuli o (3) distacco della perla dal microtubulo della rodamina.
    8. Disattiva la trappola per rilasciare il tallone e ripeti l'esperimento come desiderato. Una tipica camera di campionamento può essere utilizzata per circa 30 minuti prima che si verifichi la degradazione dei fasci e la perdita di attività proteica.
      NOTA: Gli effetti di degradazione variano a seconda del reticolante utilizzato, ma possono manifestarsi come la formazione di puncta statici sui microtubuli o sulla superficie, la perdita di fluttuazioni dei microtubuli che indicano un legame non specifico o l'incapacità di attaccare stabilmente le perle ai microtubuli.

7. Analisi dei dati e correlazione delle immagini a fluorescenza con registrazioni di trappole ottiche

NOTA: Per ottimizzare la raccolta dei dati, è utile utilizzare due sistemi di controllo computerizzati separati: uno per il software di intrappolamento ottico e un altro per l'imaging a fluorescenza. Questa configurazione consente l'acquisizione di dati ad alta velocità in entrambe le modalità sperimentali ed elimina i ritardi di nano e microsecondi nell'esecuzione delle operazioni che vengono introdotti nei dati, che possono verificarsi quando si utilizza una singola CPU.

  1. Digitalizzare i dati di intrappolamento ottico ad una velocità ottimizzata per le proteine di reticolazione motorie o non motorie impiegate e le loro velocità attese di stepping (ad esempio, tipicamente tra 1-10 kHz).
  2. Registra i segnali di tensione X, Y e SUM dal fotorivelatore sensibile alla posizione, nonché i dati posizionali X, Y e Z dello stadio di nano-posizionamento utilizzando un software dedicato per il controllo della trappola ottica e il campionamento dei segnali di tensione digitale da questi componenti.
  3. Registrare il segnale digitale dello stato di apertura dell'otturatore dalla fotocamera con un canale di ingresso di tensione aggiuntivo sulla scheda di acquisizione dati di trapping ottico. Ciò consente la correlazione dei dati di imaging a fluorescenza con le tracce del tempo di intrappolamento ottico. Iniziare la raccolta dei dati con la trappola ottica prima dell'avvio dell'imaging in modo che il segnale della telecamera dal primo fotogramma venga registrato correttamente.
  4. Calcolare la media dei dati delle serie temporali grezze acquisiti a frequenze di campionamento elevate utilizzando un metodo di filtraggio appropriato, ad esempio una finestra scorrevole, un filtro mediano o un filtro gaussiano a seconda delle esigenze.
  5. Quantificare i dati delle serie temporali dell'immagine a fluorescenza utilizzando metodi come l'analisi linescan, in cui viene calcolato il valore di intensità dei pixel lungo la lunghezza della regione dei microtubuli. Da queste lineetraiettorie, identificare i bordi dei microtubuli e, quindi, le regioni di sovrapposizione. Inoltre, utilizzare l'intensità di fluorescenza dal canale proteico reticolante per calcolare la localizzazione, la concentrazione e la densità delle proteine.
  6. La correlazione dei dati di forza e immagine è un risultato essenziale di questo sistema sperimentale. Ad esempio, selezionare e calcolare la media di tutti i punti dati di forza all'interno di una determinata regione di esposizione della fotocamera (indicata dal corrispondente picco di segnale digitale nel canale della fotocamera) per confrontarli direttamente con il corrispondente fotogramma dell'immagine a fluorescenza. Successivamente, estrarre le relazioni tra la grandezza della forza e il numero di proteine reticolanti, la lunghezza di sovrapposizione o la distribuzione dei reticolanti.

Risultati

La preparazione di fasci di microtubuli adatti all'analisi biofisica è considerata di successo se sono soddisfatti molti dei criteri chiave. In primo luogo, l'imaging in tre colori dovrebbe rivelare due microtubuli allineati con una concentrazione di proteina reticolante che decora preferenzialmente la regione di sovrapposizione (Figura 5B, C e Figura 6B). Idealmente, la distanza tra il bordo di sovrapposizione e l'estremità l...

Discussione

Le reti di microtubuli sono impiegate da una miriade di tipi di cellule per svolgere una vasta gamma di compiti che sono fondamentalmente di natura meccanica. Per descrivere come funzionano le cellule sia in stato sano che in stato di malattia, è fondamentale capire come queste reti su scala micron sono organizzate e regolate dalle proteine di dimensioni nanometriche che collettivamente le costruiscono. Strumenti biofisici come le pinzette ottiche sono adatti per sondare la meccanochimica di proteine chiave su questa sc...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano riconoscere il supporto di R21 AG067436 (a JP e SF), T32 AG057464 (a ET) e Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (a SF).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nmIPG PhotonicsYLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applicationsChromaTRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin ConjugateInvitrogen#MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC gradeFisher Scientific18-608-395
Alpha casein from bovine milkSigma1002484390
ATPFisher ScientificBP413-25
BenzonaseNovagen70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio, Inc.NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta CellsMillipore Sigma71-400-3
CatalaseMP Biomedicals LLC190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objectiveNikonN/A
ChloramphenicolACROS Organics227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslipsFisher ScientificC14784
Delicate Task WipersKimberly-Clark34120
Dextrose AnhydrousFisher ScientificBP3501
D-SucroseFisher ScientificBP220-1
DTTFisher ScientificBP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 BathLAUDA-Brinkmann27709
EDTAFisher ScientificBP118-500
EGTAMillipore Corporation32462-25GM
FIJI / Image Jhttps://fiji.sc/N/A
Frosted Microscope SlidesCorning12-553-1075mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose OxidaseMP Biomedicals LLC195196Type VII, without added oxygen
GMPCPPJena BiosciencesJBS-NU-405SCan be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover GlassThermo Scientific3405
HEPESFisher ScientificBP310-500
ImidazoleFisher Scientific03196-500
IPTGFisher ScientificBP1755-10
Laboratory dessicatorBel-Art999320237190mm plate size
Kanamycin SulfateFischer ScientificBP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6HisGilbert Lab, RPIN/Adoi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
KimwipeKimberley ClarkZ188956lint-free tissue
Immersion Oil, Type BCargille16484
Lens TissueThorLabsMC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm)NikonN/A
LysozymeMP Biomedicals LLC100834
Magnesium Acetate TetrahydrateFisher ScientificBP215-500
Microfuge 18Beckman Coulter367160
MPEG-SVA MW-5000Laysan Bio, Inc.NC0107576
NeutravadinInvitrogenPI31000
Nikon Ti-E inverted microscopeNikonN/ANikon LuN4 Laser
Ni-NTA ResinThermo Scientific88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		IDTN/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		IDTN/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mmBeckman Coulter343755
Optima-TLX UltracentrifugeBeckman Coulter361544
Paclitaxel (Taxol equivalent)Thermo Fisher ScientificP3456
PIPESACROS Organics172615000
PMSFMillipore7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin labelCytoskeleton, Inc.T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 FluorCytoskeleton, Inc.TL670Mfar red labelled
Porcine Tubulin, RhodamineCytoskeleton, Inc.TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin ProteinCytoskeleton, Inc.T240
Potassium AcetateFisher ScientificBP364-500
Prime 95B sCMOS cameraPhotometricN/A
Quadrant Detector Sensor HeadThorLabsPDQ80A
Quikchange Lightning KitAgilent Technologies210518
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233-500
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Square Cover GlassesCorning12-553-45018 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin MicrospheresPolysciences Inc.24162-1
Superose-6 ColumnGE Healthcare29-0915--96
TCEPThermo Scientific77720
TLA-100 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator)VevorJPS-08A(DD)304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solutionVector LaboratoriesSP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-DS.C. JohnsonSJN695237

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