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* Questi autori hanno contribuito in egual misura
Qui, presentiamo un protocollo per ricostituire i fasci di microtubuli in vitro e quantificare direttamente le forze esercitate al loro interno utilizzando l'intrappolamento ottico simultaneo e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Questo test consente la misurazione su scala nanometrica delle forze e degli spostamenti generati dagli insiemi proteici all'interno delle reti di microtubuli attivi.
Le reti di microtubuli sono impiegate nelle cellule per svolgere una vasta gamma di compiti, che vanno dall'agire come tracce per il trasporto delle vescicole al lavoro come array specializzati durante la mitosi per regolare la segregazione cromosomica. Le proteine che interagiscono con i microtubuli includono motori come chinesine e dineina, che possono generare forze attive e movimento direzionale, nonché proteine non motorie che reticolano i filamenti in reti di ordine superiore o regolano la dinamica dei filamenti. Ad oggi, gli studi biofisici sulle proteine associate ai microtubuli si sono concentrati in modo schiacciante sul ruolo delle singole proteine motorie necessarie per il trasporto delle vescicole e sono stati compiuti progressi significativi nel chiarire le proprietà generatrici di forza e la regolazione meccanochimica delle chinesine e delle dineine. Tuttavia, per i processi in cui i microtubuli agiscono sia come carico che come traccia, come durante lo scorrimento del filamento all'interno del fuso mitotico, si capisce molto meno sulla regolazione biofisica degli insiemi delle proteine reticolanti coinvolte. Qui, descriviamo in dettaglio la nostra metodologia per sondare direttamente la generazione e la risposta della forza all'interno di reti minime di microtubuli reticolati ricostituiti da microtubuli purificati e proteine mitotiche. Le coppie di microtubuli sono reticolate da proteine di interesse, un microtubulo è immobilizzato su un vetrino di copertura del microscopio e il secondo microtubulo è manipolato da una trappola ottica. La microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale simultanea consente la visualizzazione multicanale di tutti i componenti di questa rete di microtubuli mentre i filamenti si allontanano per generare forza. Dimostriamo anche come queste tecniche possono essere utilizzate per sondare le forze di spinta esercitate dagli insiemi di kinesina-5 e come le forze di frenata viscosa si verificano tra coppie di microtubuli scorrevoli reticolate dal mitotico MAP PRC1. Questi saggi forniscono approfondimenti sui meccanismi di assemblaggio e funzione del fuso e possono essere più ampiamente adattati per studiare la meccanica delle reti di microtubuli densi in diversi contesti, come l'assone e i dendriti dei neuroni e delle cellule epiteliali polari.
Le cellule impiegano reti di microtubuli per eseguire un'ampia varietà di compiti meccanici, che vanno dal trasporto delle vescicole 1,2,3 alla segregazione cromosomica durante la mitosi 4,5,6. Molte delle proteine che interagiscono con i microtubuli, come le proteine molecolari kinesina e dineina, generano forze e sono regolate da carichi meccanici. Per capire meglio come funzionano queste molecole critiche, i ricercatori hanno impiegato metodi biofisici a singola molecola, come l'....
1. Preparazione di microtubuli
NOTA: Quando si utilizzano proteine reticolanti marcate con GFP, l'etichettatura dei fluorofori organici rossi (ad esempio, rodamina) e rosso lontano (ad esempio, HiLyte647 biotinilato, indicato come rosso lontano biotinilato nel resto del testo) l'etichettatura dei fluorofori organici dei microtubuli funziona bene. La diafonia minima tra tutti e tre i canali può essere ottenuta durante l'imaging utilizzando un filtro a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) quad band di alta qualità.
La preparazione di fasci di microtubuli adatti all'analisi biofisica è considerata di successo se sono soddisfatti molti dei criteri chiave. In primo luogo, l'imaging in tre colori dovrebbe rivelare due microtubuli allineati con una concentrazione di proteina reticolante che decora preferenzialmente la regione di sovrapposizione (Figura 5B, C e Figura 6B). Idealmente, la distanza tra il bordo di sovrapposizione e l'estremità l.......
Le reti di microtubuli sono impiegate da una miriade di tipi di cellule per svolgere una vasta gamma di compiti che sono fondamentalmente di natura meccanica. Per descrivere come funzionano le cellule sia in stato sano che in stato di malattia, è fondamentale capire come queste reti su scala micron sono organizzate e regolate dalle proteine di dimensioni nanometriche che collettivamente le costruiscono. Strumenti biofisici come le pinzette ottiche sono adatti per sondare la meccanochimica di proteine chiave su questa sc.......
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Gli autori desiderano riconoscere il supporto di R21 AG067436 (a JP e SF), T32 AG057464 (a ET) e Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (a SF).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm | IPG Photonics | YLR-10-1064-LP | |
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications | Chroma | TRF89901v2 | |
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate | Invitrogen | #MA1-21315-BTIN | |
Acetone, HPLC grade | Fisher Scientific | 18-608-395 | |
Alpha casein from bovine milk | Sigma | 1002484390 | |
ATP | Fisher Scientific | BP413-25 | |
Benzonase | Novagen | 70746-3 | |
Biotin-PEG-SVA-5000 | Laysan Bio, Inc. | NC0479433 | |
BL21 (DE3) Rosetta Cells | Millipore Sigma | 71-400-3 | |
Catalase | MP Biomedicals LLC | 190311 | |
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective | Nikon | N/A | |
Chloramphenicol | ACROS Organics | 227920250 | |
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips | Fisher Scientific | C14784 | |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 | |
Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP3501 | |
D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
DTT | Fisher Scientific | BP172-25 | |
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath | LAUDA-Brinkmann | 27709 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
EGTA | Millipore Corporation | 32462-25GM | |
FIJI / Image J | https://fiji.sc/ | N/A | |
Frosted Microscope Slides | Corning | 12-553-10 | 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm |
Glucose Oxidase | MP Biomedicals LLC | 195196 | Type VII, without added oxygen |
GMPCPP | Jena Biosciences | JBS-NU-405S | Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C |
Gold Seal-Cover Glass | Thermo Scientific | 3405 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
Imidazole | Fisher Scientific | 03196-500 | |
IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
Laboratory dessicator | Bel-Art | 999320237 | 190mm plate size |
Kanamycin Sulfate | Fischer Scientific | BP906-5 | |
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His | Gilbert Lab, RPI | N/A | doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182 |
Kimwipe | Kimberley Clark | Z188956 | lint-free tissue |
Immersion Oil, Type B | Cargille | 16484 | |
Lens Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) | Nikon | N/A | |
Lysozyme | MP Biomedicals LLC | 100834 | |
Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher Scientific | BP215-500 | |
Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
MPEG-SVA MW-5000 | Laysan Bio, Inc. | NC0107576 | |
Neutravadin | Invitrogen | PI31000 | |
Nikon Ti-E inverted microscope | Nikon | N/A | Nikon LuN4 Laser |
Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC | IDT | N/A | |
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG | IDT | N/A | |
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm | Beckman Coulter | 343755 | |
Optima-TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361544 | |
Paclitaxel (Taxol equivalent) | Thermo Fisher Scientific | P3456 | |
PIPES | ACROS Organics | 172615000 | |
PMSF | Millipore | 7110-5GM | |
Porcine Tubulin, biotin label | Cytoskeleton, Inc. | T333P | |
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor | Cytoskeleton, Inc. | TL670M | far red labelled |
Porcine Tubulin, Rhodamine | Cytoskeleton, Inc. | TL590M | |
Porcine Tubulin, Tubulin Protein | Cytoskeleton, Inc. | T240 | |
Potassium Acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
Prime 95B sCMOS camera | Photometric | N/A | |
Quadrant Detector Sensor Head | ThorLabs | PDQ80A | |
Quikchange Lightning Kit | Agilent Technologies | 210518 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Square Cover Glasses | Corning | 12-553-450 | 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm |
Streptavidin Microspheres | Polysciences Inc. | 24162-1 | |
Superose-6 Column | GE Healthcare | 29-0915--96 | |
TCEP | Thermo Scientific | 77720 | |
TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) | Vevor | JPS-08A(DD) | 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power |
Vectabond APTES solution | Vector Laboratories | SP-1800-7 | |
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D | S.C. Johnson | SJN695237 |
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