Misurazione diretta delle forze all'interno di fasci di microtubuli attivi ricostituiti

Le reti di microtubuli sono impiegate nelle cellule per svolgere una vasta gamma di compiti, che vanno dall'agire come tracce per il trasporto delle vescicole al lavoro come array specializzati durante la mitosi per regolare la segregazione cromosomica. Le proteine che interagiscono con i microtubuli includono motori come chinesine e dineina, che possono generare forze attive e movimento direzionale, nonché proteine non motorie che reticolano i filamenti in reti di ordine superiore o regolano la dinamica dei filamenti. Ad oggi, gli studi biofisici sulle proteine associate ai microtubuli si sono concentrati in modo schiacciante sul ruolo delle singole proteine motorie necessarie per il trasporto delle vescicole e sono stati compiuti progressi significativi nel chiarire le proprietà generatrici di forza e la regolazione meccanochimica delle chinesine e delle dineine. Tuttavia, per i processi in cui i microtubuli agiscono sia come carico che come traccia, come durante lo scorrimento del filamento all'interno del fuso mitotico, si capisce molto meno sulla regolazione biofisica degli insiemi delle proteine reticolanti coinvolte. Qui, descriviamo in dettaglio la nostra metodologia per sondare direttamente la generazione e la risposta della forza all'interno di reti minime di microtubuli reticolati ricostituiti da microtubuli purificati e proteine mitotiche. Le coppie di microtubuli sono reticolate da proteine di interesse, un microtubulo è immobilizzato su un vetrino di copertura del microscopio e il secondo microtubulo è manipolato da una trappola ottica. La microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale simultanea consente la visualizzazione multicanale di tutti i componenti di questa rete di microtubuli mentre i filamenti si allontanano per generare forza. Dimostriamo anche come queste tecniche possono essere utilizzate per sondare le forze di spinta esercitate dagli insiemi di kinesina-5 e come le forze di frenata viscosa si verificano tra coppie di microtubuli scorrevoli reticolate dal mitotico MAP PRC1. Questi saggi forniscono approfondimenti sui meccanismi di assemblaggio e funzione del fuso e possono essere più ampiamente adattati per studiare la meccanica delle reti di microtubuli densi in diversi contesti, come l'assone e i dendriti dei neuroni e delle cellule epiteliali polari.