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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per ricostituire i fasci di microtubuli in vitro e quantificare direttamente le forze esercitate al loro interno utilizzando l'intrappolamento ottico simultaneo e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Questo test consente la misurazione su scala nanometrica delle forze e degli spostamenti generati dagli insiemi proteici all'interno delle reti di microtubuli attivi.

Abstract

Le reti di microtubuli sono impiegate nelle cellule per svolgere una vasta gamma di compiti, che vanno dall'agire come tracce per il trasporto delle vescicole al lavoro come array specializzati durante la mitosi per regolare la segregazione cromosomica. Le proteine che interagiscono con i microtubuli includono motori come chinesine e dineina, che possono generare forze attive e movimento direzionale, nonché proteine non motorie che reticolano i filamenti in reti di ordine superiore o regolano la dinamica dei filamenti. Ad oggi, gli studi biofisici sulle proteine associate ai microtubuli si sono concentrati in modo schiacciante sul ruolo delle singole proteine motorie necessarie per il trasporto delle vescicole e sono stati compiuti progressi significativi nel chiarire le proprietà generatrici di forza e la regolazione meccanochimica delle chinesine e delle dineine. Tuttavia, per i processi in cui i microtubuli agiscono sia come carico che come traccia, come durante lo scorrimento del filamento all'interno del fuso mitotico, si capisce molto meno sulla regolazione biofisica degli insiemi delle proteine reticolanti coinvolte. Qui, descriviamo in dettaglio la nostra metodologia per sondare direttamente la generazione e la risposta della forza all'interno di reti minime di microtubuli reticolati ricostituiti da microtubuli purificati e proteine mitotiche. Le coppie di microtubuli sono reticolate da proteine di interesse, un microtubulo è immobilizzato su un vetrino di copertura del microscopio e il secondo microtubulo è manipolato da una trappola ottica. La microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale simultanea consente la visualizzazione multicanale di tutti i componenti di questa rete di microtubuli mentre i filamenti si allontanano per generare forza. Dimostriamo anche come queste tecniche possono essere utilizzate per sondare le forze di spinta esercitate dagli insiemi di kinesina-5 e come le forze di frenata viscosa si verificano tra coppie di microtubuli scorrevoli reticolate dal mitotico MAP PRC1. Questi saggi forniscono approfondimenti sui meccanismi di assemblaggio e funzione del fuso e possono essere più ampiamente adattati per studiare la meccanica delle reti di microtubuli densi in diversi contesti, come l'assone e i dendriti dei neuroni e delle cellule epiteliali polari.

Introduzione

Le cellule impiegano reti di microtubuli per eseguire un'ampia varietà di compiti meccanici, che vanno dal trasporto delle vescicole 1,2,3 alla segregazione cromosomica durante la mitosi 4,5,6. Molte delle proteine che interagiscono con i microtubuli, come le proteine molecolari kinesina e dineina, generano forze e sono regolate da carichi meccanici. Per capire meglio come funzionano queste molecole critiche, i ricercatori hanno impiegato metodi biofisici a singola molecola, come l'....

Protocollo

1. Preparazione di microtubuli

NOTA: Quando si utilizzano proteine reticolanti marcate con GFP, l'etichettatura dei fluorofori organici rossi (ad esempio, rodamina) e rosso lontano (ad esempio, HiLyte647 biotinilato, indicato come rosso lontano biotinilato nel resto del testo) l'etichettatura dei fluorofori organici dei microtubuli funziona bene. La diafonia minima tra tutti e tre i canali può essere ottenuta durante l'imaging utilizzando un filtro a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) quad band di alta qualità.

  1. Preparare le scorte di semi di microtubuli GMPCPP
    1. Sospendere 1 mg di tubulina liofi....

Risultati

La preparazione di fasci di microtubuli adatti all'analisi biofisica è considerata di successo se sono soddisfatti molti dei criteri chiave. In primo luogo, l'imaging in tre colori dovrebbe rivelare due microtubuli allineati con una concentrazione di proteina reticolante che decora preferenzialmente la regione di sovrapposizione (Figura 5B, C e Figura 6B). Idealmente, la distanza tra il bordo di sovrapposizione e l'estremità l.......

Discussione

Le reti di microtubuli sono impiegate da una miriade di tipi di cellule per svolgere una vasta gamma di compiti che sono fondamentalmente di natura meccanica. Per descrivere come funzionano le cellule sia in stato sano che in stato di malattia, è fondamentale capire come queste reti su scala micron sono organizzate e regolate dalle proteine di dimensioni nanometriche che collettivamente le costruiscono. Strumenti biofisici come le pinzette ottiche sono adatti per sondare la meccanochimica di proteine chiave su questa sc.......

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano riconoscere il supporto di R21 AG067436 (a JP e SF), T32 AG057464 (a ET) e Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (a SF).

....

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nmIPG PhotonicsYLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applicationsChromaTRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin ConjugateInvitrogen#MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC gradeFisher Scientific18-608-395
Alpha casein from bovine milkSigma1002484390
ATPFisher ScientificBP413-25
BenzonaseNovagen70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio, Inc.NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta CellsMillipore Sigma71-400-3
CatalaseMP Biomedicals LLC190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objectiveNikonN/A
ChloramphenicolACROS Organics227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslipsFisher ScientificC14784
Delicate Task WipersKimberly-Clark34120
Dextrose AnhydrousFisher ScientificBP3501
D-SucroseFisher ScientificBP220-1
DTTFisher ScientificBP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 BathLAUDA-Brinkmann27709
EDTAFisher ScientificBP118-500
EGTAMillipore Corporation32462-25GM
FIJI / Image Jhttps://fiji.sc/N/A
Frosted Microscope SlidesCorning12-553-1075mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose OxidaseMP Biomedicals LLC195196Type VII, without added oxygen
GMPCPPJena BiosciencesJBS-NU-405SCan be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover GlassThermo Scientific3405
HEPESFisher ScientificBP310-500
ImidazoleFisher Scientific03196-500
IPTGFisher ScientificBP1755-10
Laboratory dessicatorBel-Art999320237190mm plate size
Kanamycin SulfateFischer ScientificBP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6HisGilbert Lab, RPIN/Adoi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
KimwipeKimberley ClarkZ188956lint-free tissue
Immersion Oil, Type BCargille16484
Lens TissueThorLabsMC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm)NikonN/A
LysozymeMP Biomedicals LLC100834
Magnesium Acetate TetrahydrateFisher ScientificBP215-500
Microfuge 18Beckman Coulter367160
MPEG-SVA MW-5000Laysan Bio, Inc.NC0107576
NeutravadinInvitrogenPI31000
Nikon Ti-E inverted microscopeNikonN/ANikon LuN4 Laser
Ni-NTA ResinThermo Scientific88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC
IDTN/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG
IDTN/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mmBeckman Coulter343755
Optima-TLX UltracentrifugeBeckman Coulter361544
Paclitaxel (Taxol equivalent)Thermo Fisher ScientificP3456
PIPESACROS Organics172615000
PMSFMillipore7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin labelCytoskeleton, Inc.T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 FluorCytoskeleton, Inc.TL670Mfar red labelled
Porcine Tubulin, RhodamineCytoskeleton, Inc.TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin ProteinCytoskeleton, Inc.T240
Potassium AcetateFisher ScientificBP364-500
Prime 95B sCMOS cameraPhotometricN/A
Quadrant Detector Sensor HeadThorLabsPDQ80A
Quikchange Lightning KitAgilent Technologies210518
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233-500
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Square Cover GlassesCorning12-553-45018 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin MicrospheresPolysciences Inc.24162-1
Superose-6 ColumnGE Healthcare29-0915--96
TCEPThermo Scientific77720
TLA-100 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator)VevorJPS-08A(DD)304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solutionVector LaboratoriesSP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-DS.C. JohnsonSJN695237

Riferimenti

  1. Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
  2. Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bo....

Ristampe e Autorizzazioni

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BiologiaNumero 183microtubulitrappolaggio otticomitosisingola molecolafusomeccanicachinesinaproteine associate ai microtubulimicrosopia a fluorescenza

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