Análise de molécula única de motores da família Sf9 superprocessiva superprocessiva cinesina-3

Um ambiente celular complexo apresenta desafios para a análise da motilidade de molécula única. No entanto, o avanço nas técnicas de imagem melhorou os estudos de molécula única e ganhou imensa popularidade na detecção e compreensão do comportamento dinâmico de moléculas marcadas com fluorescência. Aqui, descrevemos um método detalhado para estudos in vitro de molécula única de motores da família da cinesina-3 usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF). Kinesin-3 é uma grande família que desempenha papéis críticos em funções celulares e fisiológicas que vão desde o transporte de carga intracelular para a divisão celular para o desenvolvimento. Mostramos anteriormente que os motores de cinesina dimérica-3 constitutivamente ativos exibem motilidade rápida e superprocessiva com alta afinidade de microtúbulos no nível de molécula única usando lisados celulares preparados por expressão motora em células de mamíferos. Nosso laboratório estuda os motores da cinesina-3 e seus mecanismos regulatórios usando abordagens celulares, bioquímicas e biofísicas, e tais estudos exigem proteínas purificadas em larga escala. A expressão e purificação desses motores usando células de mamíferos seria cara e demorada, enquanto a expressão em um sistema de expressão procariótica resultou em proteína significativamente agregada e inativa. Para superar as limitações impostas pelos sistemas de purificação bacteriana e pelo lisado de células de mamíferos, estabelecemos um sistema robusto de expressão do baculovírus Sf9 para expressar e purificar esses motores. Os motores de cinesina-3 são C-terminalmente marcados com proteínas fluorescentes de 3 tandem (3xmCitirine ou 3xmCit) que fornecem sinais aprimorados e fotobranqueamento diminuído. A análise in vitro de gliding de molécula única e multimotor de proteínas purificadas Sf9 demonstra que os motores de cinesina-3 são rápidos e superprocessivos semelhantes aos nossos estudos anteriores usando lisatos de células de mamíferos. Outras aplicações que usam esses ensaios incluem conhecimento detalhado das condições dos oligômeros dos motores, parceiros de ligação específicos em paralelo com estudos bioquímicos e seu estado cinético.