Ex Vivo Органоидная модель аденовирусно-cre опосредованных делеций генов в уротелиальных клетках мышей

Рак мочевого пузыря является недостаточно изученной областью, особенно в генетически модифицированных моделях мышей (GEMM). Инбредные GEMM с тканеспецифическими сайтами Cre и loxP были золотыми стандартами для условного или индуцируемого нацеливания генов. Для обеспечения более быстрых и эффективных экспериментальных моделей разработана система культуры органоидов ex vivo с использованием аденовируса Cre и нормальных уротелиальных клеток, несущих множественные аллели loxP супрессоров опухоли Trp53, Pten и Rb1. Нормальные уротелиальные клетки ферментативно отделены от четырех мочевых пузырей мышей с тройным флоксом (Trp53^f/f: Pten^f/f: Rb1^f/f). Уротелиальные клетки трансдуцируются ex vivo с аденовирусом-Cre, приводимым в действие промотором ЦМВ (Ad5CMVCre). Трансдуцированные органоиды мочевого пузыря культивируются, размножаются и характеризуются in vitro и in vivo. ПЦР используется для подтверждения делеций генов в Trp53, Pten и Rb1. Иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание органоидов демонстрирует положительную экспрессию маркеров уротелиальной линии (CK5 и p63). Органоиды вводятся подкожно мышам-хозяевам для расширения опухоли и последовательных проходов. Иммуногистохимия (IHC) ксенотрансплантатов демонстрирует положительную экспрессию CK7, CK5 и p63 и отрицательную экспрессию CK8 и Uroplakin 3. Таким образом, опосредованная аденовирусом делеция генов из уротелиальных клеток мыши, спроектированных с сайтами loxP, является эффективным методом быстрой проверки опухолевого потенциала определенных генетических изменений.