Kemisk trifosforylering av oligonukleotider

5′-trifosfatet är en väsentlig nukleinsyramodifiering som finns under hela livet och används alltmer som en funktionell modifiering av oligonukleotider inom bioteknik och syntetisk biologi. Oligonukleotid 5′-trifosfater har historiskt framställts in vitro med enzymatiska metoder. Dessa metoder är emellertid begränsade till naturliga RNA-oligonukleotider, har starka sekvenspreferenser och tenderar att producera heterogena produkter. Nya metoder för kemisk trifosforylering kompletterar både den reducerade kostnaden för automatiserad oligonukleotidsyntes genom fosforamiditkemi och det varierande utbudet av nukleotidmodifieringar som nu finns tillgängliga. Således är syntesen av oligonukleotidtrifosfater av godtycklig sekvens och längd, och eventuellt innehållande olika ickenaturliga modifieringar, nu tillgänglig.

Detta dokument presenterar lämpliga metoder och tekniker för kemisk trifosforylering av oligonukleotider med användning av salicylfosforkloridit och pyrofosfat. Denna metod använder kommersiellt tillgängliga reagenser, är kompatibel med de flesta oligonukleotider framställda med standard fastfassyntesmetoder och kan slutföras i 2 timmar efter oligonukleotidsyntes, före deprotektion och rening. Två användningar av kemiskt trifosforylerade oligonukleotider som substrat för katalytiska RNA-enzymer demonstreras, inklusive syntesen av en spegelbildsversion av hammarhuvudet ribozym från icke-biologiska L-RNA-trifosfater.