La perfusione macchina ex vivo normomica (NEVP) è stata scarsamente esplorata per la conservazione degli allotrapianti pancreatici. Presentiamo una tecnica di conservazione innovativa per gli allotrapianti del pancreas prima del trapianto.
Il trapianto di pancreas (PTx) è un trattamento curativo per le persone che vivono con il peso di una diagnosi di diabete mellito (DM). Tuttavia, a causa della carenza di organi e del crescente numero di pazienti elencati per PTx, sono necessarie nuove strategie per aumentare il numero di innesti disponibili per il trapianto.
La conservazione a freddo statica (SCS) è considerata il gold standard per gli organi a criteri standard. Tuttavia, i donatori con criteri standard (SCD) stanno diventando scarsi e sono urgentemente necessarie nuove strategie che possano aumentare il tasso di accettazione di organi da donatori a criteri estesi (ECD).
La perfusione normemica ex vivo (NEVP) è una delle strategie che è diventata sempre più popolare negli ultimi due decenni. Questo metodo di conservazione è già stato utilizzato con successo in altri organi (fegato, reni e polmoni), ma è stato minimamente esplorato nel trapianto di pancreas. I pochi articoli che descrivono il metodo per il pancreas mostrano scarso successo, l'edema è uno dei problemi principali. Il seguente manoscritto descrive il metodo NEVP di successo e la configurazione sviluppata dal nostro gruppo per perfondere il pancreas suino.
Secondo il National Diabetes Statistics Report, un totale di 28,7 milioni di persone negli Stati Uniti vivevano con una diagnosi di diabete nel 2019. Circa 1,8 milioni di questi avevano una diagnosi di diabete di tipo 11. PTx è attualmente il trattamento più efficace e unico curativo per il diabete mellito di tipo 1 complicato2 ed è una procedura che aumenta sia l'aspettativa di vita che la qualità della vita di questi pazienti3.
Il pancreas è l'organo più spesso scartato dopo il prelievo da donatori deceduti4. Con la continua carenza di organi e l'aumento dei tempi delle liste d'attesa, i centri di trapianto utilizzano più innesti di pancreas da ECD, compresa la donazione dopo la morte circolatoria (DCD)5. Sono necessarie strategie per conservare, perfondere, valutare e riparare in modo sicuro gli allotrapianti provenienti da donatori con criteri estesi.
NEVP ha dimostrato di avere successo nella conservazione del polmone6, fegato7,8 e innesti renali 9,10. Tuttavia, il numero di gruppi che lavorano sulla perfusione della macchina per il pancreas, sia ipotermica che normotermica, e il numero di pubblicazioni, sono pochi e limitati a causa dell'edema e della lesione del trapianto11,12,13,14.
L'obiettivo di questo studio è quello di presentare un protocollo per la perfusione normotermica ex vivo del pancreas (NEVPP), utilizzando un modello suino con l'obiettivo di fornire una piattaforma per la conservazione prolungata, la valutazione degli organi e la riparazione prima del trapianto. Ciò consentirà ad altri gruppi di ricerca di stabilire un modello di perfusione per lo studio degli allotrapianti pancreatici.
Tutti gli animali utilizzati per questo studio hanno ricevuto cure umane in conformità con i "Principi di cura degli animali da laboratorio" formulati dalla National Society for Medical Research e la "Guida per la cura degli animali da laboratorio" pubblicata dal National Institutes of Health, Ontario, Canada. Tutti gli studi sono stati approvati dall'Animal Care Committee del Toronto General Research Institute.
NOTA: Questo protocollo di studio si basa su un modello suino. L'innesto viene conservato al freddo per 2 ore e poi subisce la perfusione normotermica della macchina per 3 ore prima del trapianto (Figura 1).
1. Animali
2. Approvvigionamento di organi
NOTA: La procedura preoperatoria e parte della procedura chirurgica sono le stesse dei precedenti articoli pubblicati dal nostro gruppo15 ed è la seguente:
3. Procedura chirurgica
4. Preparazione del tavolo posteriore dell'innesto pancreatico (Figura 2A)
5. Perfusione cerebrale ex vivo del pancreas (NEVPP)
NOTA: Il circuito di perfusione è costituito da apparecchiature di bypass cardiopolmonare neonatale (Figura 3).
6. Preparazione del perfusato e adescamento del circuito
7. Perfusione dell'innesto di pancreas (Figura 2B)
I prossimi dati mostrano i risultati rappresentativi di sette esperimenti che utilizzano un modello di recupero del pancreas del donatore che batte cardiaco. Dopo l'incannulamento dell'aorta, il lavaggio con la soluzione UW e il recupero del pancreas, gli innesti sono stati tenuti su SCS per 2 ore mentre i globuli rossi venivano preparati. NEVPP è stato eseguito in questo modello per 3 ore, quello che abbiamo considerato il minor tempo necessario per la perfusione se la valutazione e la riparazione dell'innesto sono previste in futuro. I campioni e le misurazioni sono stati registrati in punti temporali orari. (0 = linea di base, subito dopo che l'organo è collegato al circuito, 1 = 1 h, 2 = 2 h, 3 = 3 h).
Gli innesti di pancreas sono stati posizionati su una camera d'organo progettata su misura per questo scopo e include un riscaldatore (file supplementare). Lo scopo di NEVPP è quello di fornire un ambiente quasi fisiologico per l'organo. A tale scopo, la pressione arteriosa è stata impostata per rimanere tra 20-25 mmHg in tutte le perfusioni. La pressione e il flusso sono stati misurati durante l'intera perfusione e sono rimasti stabili (Figura 4). L'attività metabolica è stata stimata calcolando il consumo di ossigeno dell'innesto utilizzando la seguente formula: [(pO 2art-pO2ven) * flusso / peso] (Figura 5). Le misurazioni di pH, sodio, calcio e HCO3 erano all'interno dei valori fisiologici durante l'intera perfusione (Figura 6). I livelli di lattato e potassio sono diminuiti durante la perfusione e hanno raggiunto valori vicini alla norma a 3 ore (Figura 7). Poiché il circuito è un sistema chiuso, si prevede che i livelli di amilasi e lipasi aumentino durante la perfusione (Figura 8). Tuttavia, l'aumento dei livelli non sembra essere correlato con il danno all'innesto (Figura 9). Una scala semiquantitativa è stata utilizzata per valutare la necrosi del grasso e del parenchima e l'integrità delle cellule insulari. (0 - nessun cambiamento, 1 - cambiamenti lievi, 2 - cambiamenti moderati, 3 - cambiamenti gravi). Questo è stato fatto da un patologo cieco ai gruppi sperimentali e non sono stati osservati segni di pancreatite.
Gli allotrapianti del pancreas sono stati pesati prima e dopo la perfusione per valutare l'edema (Tabella 2).
Figura 1. Protocollo di studio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Pancreas prima e dopo la perfusione. (A) Prima della perfusione. (B) Dopo perfusione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. Disegno schematico del circuito di perfusione. Con l'uso della tecnologia di bypass cardiopolmonare neonatale; Il perfusato viene versato nel serbatoio venoso e quindi spinto con l'aiuto di una pompa centrifuga nell'ossigenatore. Dopo aver lasciato l'ossigenatore, il circuito si divide in tubi che inviano il perfustato alla cassetta di dialisi e di nuovo al serbatoio e al tubo che va al filtro arterioso. Dopo aver superato il filtro a bolle arteriose, il perfusato viene guidato con una pressione di 20-25 mmHg attraverso l'aorta nel pancreas. Il deflusso venoso riporta il perfufato nel serbatoio venoso. (Adattato da 18). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4. Flusso arterioso medio con deviazione standard (ml/min). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5. Consumo medio di ossigeno con deviazione standard (ml/min/g). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6. (A) Misurazioni medie di pH, (B)HCO 3, (C) sodio e (D) calcio con deviazioni standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7. (A) Misurazioni medie del lattato e (B) del potassio con deviazioni standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8. (A) Misurazioni medie dell'amilasi e della (B) lipasi con deviazioni standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9. Biopsie core prima e dopo la perfusione. (A) Parenchima pancreatico normale prima della perfusione della macchina18. (B) Biopsia post perfusione con buona conservazione degli acini pancreatici e delle cellule insulari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Ingrediente | Importo |
Lattato di Ringer | 260 ml |
Soluzione Steen | 195 ml |
Eritrociti lavati | 162,5 ml |
Acqua a doppia osmosi inversa (DRO) | 35 ml |
Eparina (10000 UI / 10 ml) | 1,3 ml |
Bicarbonato di sodio (8,4%) | 10,4 ml |
Gluconato di calcio (10%) | 1,3 ml |
Metylprednisolone (Solu-Medrol) | 325 mg |
Aprotinina | 15 mg |
Tabella 1. Composizione perfusa.
Peso prima | Peso dopo | Guadagnare | % differenza | |
Caso 1 | 244 g | 240 g | -4 g | -1.63 |
Caso 2 | 154 g | 164 g | 10 g | 6.49 |
Caso 3 | 184 g | 245 g | 61 g | 33.15 |
Caso 4 | 190 g | 226 g | 36 g | 18.94 |
Caso 5 | 198 g | 307 g | 109 g | 55.05 |
Caso 6 | 205 g | 315 g | 107 g | 51.44 |
Caso 7 | 193 g | 256 g | 63 g | 32.64 |
Tabella 2. Peso prima e dopo la perfusione.
File supplementare: camera pancreatica personalizzata per la perfusione. Progettato in collaborazione con l'officina meccanica del Medical Physics - Radiation Medicine Program presso il Princess Margaret Cancer Centre. Clicca qui per scaricare questo file.
Questo studio dimostra che è possibile ottenere un NEVPP stabile per gli allotrapianti del pancreas con danno istologico minimo dopo 3 ore di perfusione con la configurazione precedentemente presentata. I parametri di perfusione come flusso arterioso, pressione, pH, HCO3 e Na rimangono stabili durante la perfusione e abbiamo osservato una diminuzione e stabilizzazione di K e lattato.
È di fondamentale importanza manipolare l'innesto il meno possibile durante l'approvvigionamento, la preparazione del tavolo posteriore e la perfusione. È anche molto importante mantenere uno stretto controllo della pressione arteriosa. Poiché il pancreas è un organo a bassa pressione, un aumento della pressione può causare danni irreversibili all'organo.
La preparazione del back-table per questo studio è diversa dalla preparazione degli innesti umani (Figura 2A). Poiché il pancreas era l'unico organo prelevato dai maiali, siamo stati in grado di prendere la porzione dell'aorta che comprende il tronco celiaco e l'arteria mesenterica superiore. Per quanto riguarda la vena porta, è stata eseguita un'estensione utilizzando la vena iliaca. In caso di innesti umani, la preparazione del back-table dovrà essere eseguita nello stesso modo in cui viene eseguita per il trapianto, utilizzando innesti iliaci per la ricostruzione arteriosa e l'allungamento del portale19.
Questo metodo potrebbe essere limitato dalla complessità dell'installazione. Abbiamo deciso di aggiungere una cassetta di dialisi dopo aver notato un grave edema dell'innesto quando fatto senza di esso. Per questi esperimenti è stata costruita anche una camera d'organo su misura che conteneva una fonte di riscaldamento esterna che si è rivelata strumentale per la perfusione ottimale degli innesti.
Ci sono pochi studi che descrivono la perfusione normotermica ex vivo del pancreas. Nella maggior parte di questi studi, l'edema sembra essere il principale fattore limitante. Per quanto ne sappiamo, questo metodo è l'unico rapporto sull'utilizzo di una cassetta di dialisi per controllare l'edema.
La perfusione ex vivo normemica per il pancreas è ancora agli inizi rispetto ad altri organi. I protocolli attuali si stanno concentrando su donatori a criteri estesi (DCD), miglioramento del perfuffato, tempi di perfusione più lunghi e biomarcatori per valutare il danno del trapianto durante la perfusione. I livelli di amilasi e lipasi non sembrano essere marcatori affidabili, dal momento che stiamo usando un sistema chiuso, e non sembrano correlare con l'istopatologia20. Finora, il nostro gruppo è anche riuscito a trapiantare allotrapianti di pancreas dopo perfusione con buoni risultati18.
Con i continui miglioramenti di questa tecnologia, speriamo che questa tecnologia sia applicabile al trapianto clinico e consenta la valutazione e la riparazione degli allotrapianti del pancreas. Si spera che alla fine si tradurrà in un maggiore utilizzo dell'innesto, in una riduzione dei tempi di attesa per i pazienti e in migliori risultati per i pazienti.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Nessuno.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alburex 5 | CSL Behring AG | 187337 | 25 g of Albumin (human) in 500 mL of buffered diluent |
Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153 | |
Belzer UW Cold storage solution | Bridge to life Ltd | 4055 | |
Calcium gluconate (10%) | Fresenius Kabi Canada Ltd (Toronto, ON) | C360019 | |
Composelect (blood collection bags) | Fresenius Kabi Canada Ltd | PQ31555 | |
Epoprostenol | GlaxoSmithKline Inc. | 218761 | |
Heart lung machine, Stöckert S3 | Sorin Group Canada Inc. | Custom made | Centrifugal pump, roller pump, control panel (sensors for pressure, flow, temperature, bubbles, and level), oxygen blender, heater unit |
Hemoflow, Fresenius Polysulfone | Fresenius Medical Care North America | 0520165A | |
Heparin (10000 IU/10 mL) | Fresenius Kabi Canada Ltd | C504710 | |
Lactated Ringer's solution | Baxter | JB2324 | |
Neonatal cardiopulmonary bypass techonolgy | Sorin Group Canada Inc | Custom made | Dideco perfusion tubing systems, centrifugal blood pump (Revolution), arterial blood filter, microporous hollow fibre memebrane oxygenator), cannulas |
Pancreas chamber | Custom made | With external heater | |
Percutaneous Sheath Introducer Set with Integral Hemostasis Valve/side Port for use with 7-7.5 Fr Catheters | Arrow International LLC | SI-09880 | |
Sodium bicarbonate (8.4%) | Fresenius Kabi Canada Ltd | C908950 | |
Solu-Medrol | Pfizer Canada Inc. | 52246-14-2 | |
Steen | XVIVO | 19004 | |
Urethral catheter | Bard Inc | 86020 | 20 Fr, malecot model drain |
Verapamil | Sandoz Canada Inc. | 8960 |
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