Détermination de l’affinité de liaison (K_D) des anticorps radiomarqués aux antigènes immobilisés

La détermination de l’affinité de liaison (K_D) est un aspect important de la caractérisation des anticorps radiomarqués (rAb). Typiquement, l’affinité de liaison est représentée par la constante de dissociation d’équilibre, K_D, et peut être calculée comme la concentration d’anticorps à laquelle la moitié des sites de liaison d’anticorps sont occupés à l’équilibre. Cette méthode peut être généralisée à n’importe quel anticorps radiomarqué ou à d’autres échafaudages protéiques et peptidiques. Contrairement aux méthodes cellulaires, le choix d’antigènes immobilisés est particulièrement utile pour valider les affinités de liaison après stockage à long terme des anticorps, distinguer les affinités de liaison des bras de la région de liaison à l’antigène fragmentaire (Fab) dans les constructions d’anticorps bispécifiques et déterminer s’il existe une variabilité dans l’expression de l’antigène entre les différentes lignées cellulaires. Cette méthode consiste à immobiliser une quantité fixe d’antigène dans des puits spécifiés sur une plaque cassable de 96 puits. Ensuite, la liaison non spécifique a été bloquée dans tous les puits avec de l’albumine sérique bovine (BSA). Par la suite, le rAb a été ajouté dans un gradient de concentration à tous les puits. Une gamme de concentrations a été choisie pour permettre au rAb d’atteindre la saturation, c’est-à-dire une concentration d’anticorps à laquelle tous les antigènes sont continuellement liés par le rAb. Dans les puits désignés sans antigène immobilisé, une liaison non spécifique du rAb peut être déterminée. En soustrayant la liaison non spécifique de la liaison totale dans les puits avec l’antigène immobilisé, la liaison spécifique du rAb à l’antigène peut être déterminée. Le K_D du rAb a été calculé à partir de la courbe de liaison de saturation résultante. À titre d’exemple, l’affinité de liaison a été déterminée à l’aide de l’amivantamab radiomarqué, un anticorps bispécifique pour les protéines du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) et de transition mésenchymateuse-épithéliale cytoplasmique (cMET).