Détermination de l’affinité de liaison (KD) des anticorps radiomarqués aux antigènes immobilisés

Résumé

Ici, une méthode est décrite pour déterminer l’affinité de liaison (K_D) des anticorps radiomarqués aux antigènes immobilisés. K_D est la constante de dissociation d’équilibre qui peut être déterminée à partir d’une expérience de liaison à saturation en mesurant la liaison totale, spécifique et non spécifique d’un anticorps radiomarqué à différentes concentrations à son antigène.

Résumé

La détermination de l’affinité de liaison (K_D) est un aspect important de la caractérisation des anticorps radiomarqués (rAb). Typiquement, l’affinité de liaison est représentée par la constante de dissociation d’équilibre, K_D, et peut être calculée comme la concentration d’anticorps à laquelle la moitié des sites de liaison d’anticorps sont occupés à l’équilibre. Cette méthode peut être généralisée à n’importe quel anticorps radiomarqué ou à d’autres échafaudages protéiques et peptidiques. Contrairement aux méthodes cellulaires, le choix d’antigènes immobilisés est particulièrement utile pour valider les affinités de liaison après stockage à long terme des anticorps, distinguer les affinités de liaison des bras de la région de liaison à l’antigène fragmentaire (Fab) dans les constructions d’anticorps bispécifiques et déterminer s’il existe une variabilité dans l’expression de l’antigène entre les différentes lignées cellulaires. Cette méthode consiste à immobiliser une quantité fixe d’antigène dans des puits spécifiés sur une plaque cassable de 96 puits. Ensuite, la liaison non spécifique a été bloquée dans tous les puits avec de l’albumine sérique bovine (BSA). Par la suite, le rAb a été ajouté dans un gradient de concentration à tous les puits. Une gamme de concentrations a été choisie pour permettre au rAb d’atteindre la saturation, c’est-à-dire une concentration d’anticorps à laquelle tous les antigènes sont continuellement liés par le rAb. Dans les puits désignés sans antigène immobilisé, une liaison non spécifique du rAb peut être déterminée. En soustrayant la liaison non spécifique de la liaison totale dans les puits avec l’antigène immobilisé, la liaison spécifique du rAb à l’antigène peut être déterminée. Le K_D du rAb a été calculé à partir de la courbe de liaison de saturation résultante. À titre d’exemple, l’affinité de liaison a été déterminée à l’aide de l’amivantamab radiomarqué, un anticorps bispécifique pour les protéines du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) et de transition mésenchymateuse-épithéliale cytoplasmique (cMET).

Introduction

Les anticorps radiomarqués (rAb) ont une variété d’utilisations en médecine. Alors que la majorité sont utilisés en oncologie comme agents d’imagerie et thérapeutiques, il existe des applications d’imagerie pour l’inflammation liée à la rhumatologie, la cardiologie et la neurologie¹. L’imagerie rAbs a une sensibilité élevée pour détecter les lésions et a le potentiel d’aider à la sélection des patients pour le traitement 2,3,4,5. Ils sont également utilisés pour la thérapie en raison de leur spécificité pour leurs ant....

Protocole

REMARQUE : Reportez-vous à la figure 2 pour obtenir une représentation graphique du protocole.

Figure 2 : Schéma du protocole. Les étiquettes de ligne et de colonne sont indiquées comme guide pour la mise en place de la plaque cassable à 96 puits. La liaison anticipée est montrée dans un puits d’exemple pour l’antigène et le BSA. La flèche incurvée désigne le rAb qui devrait être lavé des puits avec B....

Résultats

Cette méthode calcule l’affinité de liaison (K_D) pour un rAb sur la base du test de liaison de saturation où différentes concentrations de rAb ont été ajoutées à une quantité fixe d’antigène immobilisé. La courbe de liaison doit suivre une croissance logarithmique où elle est initialement raide, puis plafonne à mesure que l’antigène est saturé. Pour s’assurer que le K_D déterminé est exact, les concentrations de rAb doivent être suffisamment élevées pour atteindre la satur.......

Discussion

Dans le cadre du développement des rAbs, il est important de s’assurer qu’un rAb se lie spécifiquement à sa cible avec une affinité de liaison élevée. La détermination de l’affinité de liaison peut indiquer si l’immunoréactivité du rAb est affectée par la radioconjugation par le biais du test de saturation radioligand utilisant un antigène immobilisé. La détermination de la liaison du rAb à la BSA peut être utilisée pour quantifier la liaison non spécifique afin de mesurer plus précisément la .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647
Gamma Counter	Hidex	Hidex Automatic Gamma Counter
GraphPad Prism Software	GraphPad		version 9.2; used for statistical analyses in this study
Immuno Breakable MaxiSorp 96-well plates	Thermo Scientific	473768
Microplate Sealing Tape	Corning	4612
Microsoft Excel	Microsoft
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190144
Sodium Bicarbonate	JT Baker	3506-01
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	S7795
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949