מחקר זה מומן על ידי קרן החדשנות CACMS (לא. CI2021A03407), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ' 82004299), וקרנות המחקר הבסיסיות עבור מכוני המחקר המרכזיים לרווחת הציבור (לא. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של המכון לדיקור סיני ומוקסיבוסציה, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (אישור מס '2021-04-15-1). כל ההליכים נערכו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן (הוצאת האקדמיה הלאומית, וושינגטון הבירה, 1996). נעשה שימוש בשלוש חולדות זכרים בוגרים (ספראג-...

<ol>
	<li>Kawabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+relationship+among+Schwann+cells,+axons+and+postsynaptic+acetylcholine+receptor+regions+during+muscle+reinnervation+in+aged+rats.">The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats.</a> TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+extracellular+complexity+of+neuromuscular+junction+organizers.">Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).</li><li>Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+in+health+and+disease:+molecular+mechanisms+governing+synaptic+formation+and+homeostasis.">The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).</li><li>Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structural+distribution+of+acetylcholine+receptors+at+developing+mouse+neuromuscular+junctions.">Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions.</a> The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).</li><li>Desaki, J., Uehara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+maturation+of+subneural+apparatuses+at+neuromuscular+junctions+in+postnatal+rats:+a+scanning+and+transmission+electron+microscopical+study.">Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study.</a> Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).</li><li>Marques, M., Santo Neto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuromuscular+junctions+by+confocal+fluorescence+microscopy:+individual+endplates+seen+in+whole+muscles+with+vital+intracellular+staining+of+the+nerve+terminals.">Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals.</a> Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).</li><li>Magill, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury:+a+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice.">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+motor+endplates+and+its+adaptive+change+in+skeletal+muscle.">Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle.</a> Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Chen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+injection+of+-bungarotoxin+to+improve+the+efficiency+of+motor+endplate+labeling.">In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling.</a> Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).</li><li>Sugiura, Y., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-glia+interactions:+the+roles+of+Schwann+cells+in+neuromuscular+synapse+formation+and+function.">Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function.</a> Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).</li><li>Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perisynaptic+schwann+cells+-+The+multitasking+cells+at+the+developing+neuromuscular+junctions.">Perisynaptic schwann cells - The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).</li><li>Walker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+perisynaptic+Schwann+cell+and+neuromuscular+junction+research.">Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research.</a> Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).</li><li>Michaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+defects+and+breathing+disorders+in+a+new+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+endoplasmic+reticulum+stress+in+soleus+and+gastrocnemius+muscles+and+differential+response+to+UPR+pathway+in+rats.">Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats.</a> Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).</li><li>Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+the+rat+medial+gastrocnemius+muscle+based+on+inputs+to+motoneurons+and+on+an+algorithm+for+prediction+of+the+motor+unit+force.">A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).</li><li>Marinello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neuromuscular+junctions+in+mice+by+combined+confocal+and+super-resolution+microscopy.">Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).</li><li>Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+multiple+aspects+of+neurofilament+functions,+and+their+possible+contribution+to+neurodegeneration.">Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration.</a> Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).</li><li>Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilaments+and+neurofilament+proteins+in+health+and+disease.">Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).</li><li>Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinesterases+in+tripartite+neuromuscular+synapse.">Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).</li><li>Karlin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).</li><li>Rudolf, R., Straka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptor+at+vertebrate+motor+endplates:+Endocytosis,+recycling,+and+degradation.">Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation.</a> Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).</li><li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance.">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li><li>Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+guidance+of+nerve+growth+between+synaptic+sites+explains+changes+in+the+pattern+of+muscle+innervation+and+remodeling+of+synaptic+sites+following+peripheral+nerve+injuries.">Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries.</a> Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+neuromuscular+junction.">Molecular architecture of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li></ol>

תיארנו את הפרטים הטכניים הנדרשים לביצוע צביעה מרובה מוצלחת של פרוסות שרירים ושימוש באימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית לחשיפת המאפיינים המורפולוגיים של NMJ על החלקים העבים של שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה. על ידי שימוש בגישה זו, ניתן לנתח ולהעריך את הפרטים הקטנים והמתאם המרחבי של ה-PSCs ו...

כשלושה מרכיבים מבניים חיוניים של הצומת הנוירומוסקולרי (NMJ)1,2,3,4, נחקרו בהרחבה היבטים מורפולוגיים של מסופי האקסון המוטורי הקדם-סינפטי, הממברנה הפוסט-סינפטית המכילה קולטני אצטילכולין ניקוטיניים (AchRs) ותאי שוואן פרי-סינפטיים (PSCs). מקטעים דקים ודגימות שלמות של שרירי השלד נבדקו בטכניקות היסטולוגיות שונות, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים 5,6, מיקרוסקופיה קונפוקלית 7,8 ומיקרוסקופיה של יריעות אור 9,10. למרות המאפיינים המורפולוגיים של NMJ הודגמו על ידי טכניקות אלה מהיבטים שונים, כהשוואה, מיקרוסקופיה קונפוקלית היא עדיין בחירה אידיאלית להדמיה של המורפולוגיה המפורטת של NMJ.
לאחרונה פותחו טכנולוגיות חדשות רבות להצגת הרכיבים המבניים של NMJ. לדוגמה, עכברים פלואורסצנטיים מהונדסים thy1-YFP שימשו ישירות לצפייה באקסונים מוטוריים ובלוחות קצה מנועים in vivo וב- in vitro10,11. בנוסף, הזרקה תוך ורידית של α-BTX פלואורסצנטיים יושמה כדי לחשוף את ההתפלגות המרחבית של לוחות קצה מוטוריים בשרירי שלד בהרכבה מלאה של עכברים פלואורסצנטיים מסוג פראי ומהונדס, על ידי שימוש בטיפול בפינוי אופטי של רקמות לבדיקה עם מיקרוסקופיה של יריעות אור 9,12. עם זאת, מלבד האלמנטים הטרום-סינפטיים והפוסט-סינפטיים שניתן לצפות בהם בשיטות מתקדמות אלה, לא ניתן להדגים את ה-PSCs בו-זמנית.
עדויות מצטברות מצביעות על כך ש- PSCs, כתאי הגליה ההיקפיים, קשורים קשר הדוק עם ההדקים הטרום-סינפטיים התורמים להתפתחות וליציבות של NMJ, לאפנון הפעילות הסינפטית של ה- NMJ במצב הפיזיולוגי, ולהתחדשות של ה- NMJ לאחר פגיעה עצבית 13,14,15 . בהתחשב בארכיטקטורה התאית של NMJ, פרוטוקול זה הוא מועמד ראוי לתייג בו זמנית את PSCs, אלמנטים טרום ואחרי סינפטיים, והוא עשוי לשמש להערכת השלמות והפלסטיות של NMJ בתנאים נורמליים ופתולוגיים. לדוגמה, השווה את עוצמת NMJ, המורפולוגיה והנפח של לוחות קצה מוטוריים פוסט-סינפטיים, עצבנות וניתוק עצבים של NMJ, ומספר PSCs בשרירים בעלי מצב פיזיולוגי ופתולוגי.
שריר הגסטרוקנמיוס הוא השריר הגדול ביותר היוצר את הבליטה בשוק, אשר מנותח בקלות על ידי הסרת העור ושריר הירך האחורי מהגפיים. השריר נבחר לעתים קרובות כדי להעריך ניוון שרירים, ניוון עצבימוסקולרי, ביצועי שרירים וכוח יחידה מוטורית ex vivo או in vivo 16,17,18. עם זאת, הטכניקה מתאימה גם לחשיפת המאפיינים המורפולוגיים של NMJ משרירי שלד שונים. יחד עם זאת, מקטעי השרירים העבים יכולים לחשוף מורפולוגיה מלאה יותר וכמות של NMJ בהשוואה למקטעים דקים 7,8 וסיבי שרירמתגרים 19.
בהתאם למחקרים אלה, שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה נבחר כרקמת המטרה במחקר זה ונפרס בעובי של 80 מיקרומטר לצורך צביעה פלואורסצנטית מרובה עם סוגים שונים של סמנים ביולוגיים בהתאם למרכיבים המבניים של NMJ. כאן, נוירופילמנט 200 (NF200)20,21, טרנספורטר אצטילכולין שלפוחיתי (VAChT)22, אלפא-בונגארוטוקסין (α-BTX)23,24, ו-S10025,26 שימשו לסימון סיבי עצב, מסופים טרום-סינפטיים, AchRs פוסט-סינפטיים ו-PSCs בהתאמה. בנוסף, הרקע של רקמת השרירים וגרעיני התאים הוכתמו עוד יותר עם פאלואידין ו-DAPI.
במחקר זה, אנו מצפים לפתח פרוטוקול מעודן להכתמת הארכיטקטורה התאית של NMJ בו-זמנית עם הסמנים הביולוגיים המתאימים להם על דגימות קבועות עבות יותר, אשר נוח יותר לשימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית ומסייע להשיג מידע רב יותר על המבנה המפורט של PSCs, אלמנטים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, כמו גם על המתאם המרחבי שלהם זה לזה. מנקודת המבט של המתודולוגיה, פרוטוקול זה עשוי להועיל להעריך את המאפיינים המורפולוגיים של NMJ בתנאים נורמליים ופתולוגיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>149973 (703-545-155)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A11056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Neg-50</td>
			<td>Colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>10212450C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4680</td>
			<td>Chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd</td>
			<td>H37022750</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P804536</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin AF350</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision peristaltic pump</td>
			<td>Longer</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100-&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52642</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dbasic dodecahydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818118</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S817463</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818046</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4951PLUS-001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vesicular Acetylcholine Transporter</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>ANB100</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin AF647 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B35450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle

הצומת הנוירומוסקולרי (NMJ) הוא מבנה מורכב המשרת את תקשורת האותות מהנוירון המוטורי לשריר השלד ומורכב משלושה מרכיבים היסטולוגיים חיוניים: מסופי האקסון המוטורי הטרום-סינפטיים, קולטני אצטילכולין ניקוטיניים פוסט-סינפטיים (AchRs) ותאי שוואן פרי-סינפטיים (PSCs). על מנת להדגים את המאפיינים המורפולוגיים של NMJ, שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה נבחר כרקמה המטרה ונבדק על ידי שימוש בכתמים פלואורסצנטיים מרובים עם סוגים שונים של סמנים ביולוגיים, כולל נוירופילמנט 200 (NF200) וטרנספורטר אצטילכולין שלפוחיתי (VAChT) עבור סיבי העצב המוטוריים וההדקים הטרום-סינפטיים שלהם, אלפא-בונגארוטוקסין (α-BTX) עבור ה-AchRs הניקוטיניים הפוסט-סינפטיים, ו-S100 עבור ה-PSCs. במחקר זה בוצעו הכתמים בשתי קבוצות: בקבוצה הראשונה, הדגימות הוכתמו ב-NF200, VAChT ו-α-BTX, ובקבוצה השנייה הוכתמו הדגימות ב-NF200, α-BTX ו-S100. הוכח כי שני הפרוטוקולים יכולים להדגים ביעילות את המבנה המפורט של NMJ. באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי, נראו מאפיינים מורפולוגיים של ההדקים הטרום-סינפטיים, הקולטנים הפוסט-סינפטיים וה-PSC, ותמונות ערימות ה-Z שלהם שוחזרו בתבנית תלת-ממדית כדי לנתח עוד יותר את המתאם המרחבי בין התוויות השונות. מנקודת המבט של המתודולוגיה, פרוטוקולים אלה מספקים התייחסות רבת ערך לחקר המאפיינים המורפולוגיים של NMJ בתנאים פיזיולוגיים, אשר עשויים להתאים גם להעריך את השינוי הפתולוגי של NMJ, כגון פגיעה בעצבים היקפיים והתחדשות.

לאחר צביעה פלואורסצנטית מרובה, התווית המתאימה הודגמה בצורה מסודרת על החלקים בעובי של 80 מיקרומטר של שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה עם סיבי עצב חיוביים ל-NF200, מסופים קדם-סינפטיים חיוביים ל-VAChT, AchRs פוסט-סינפטיים חיוביים α-BTX, PSCs חיוביים ל-S100, סיבי שרירים חיוביים לפאלואידין וגרעיני תאים המ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle at JoVE.com

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

הפרוטוקול מראה שיטה לבחינת קורלציה מרחבית בין ההדקים הקדם-סינפטיים, הקולטנים הפוסט-סינפטיים ותאי שוואן הפרי-סינפטיים בשריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה באמצעות אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית עם סמנים ביולוגיים שונים, כלומר נוירופילמנט 200, טרנספורטר אצטילכולין שלפוחיתי, אלפא-בונגארוטוקסין ו-S100.

הדמיה של המאפיינים המורפולוגיים של צומת נוירומוסקולרי בשריר גסטרוקנמיוס מדיאלי של חולדה

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...

פרוטוקול זה יכול לשמש להערכת שלמות ופלסטיות של צומת נוירומוסקולרי בתנאים נורמליים ופתולוגיים. טכניקה זו היא לתייג בו זמנית את תאי שוואן ואת בעלי החיים לפני ואחרי המעבדה על חלקי שריר בודדים. לאחר המתת החולדה הזכרית הבוגרת, הניחו את החולדה במכסה המנוע ופתחו את חלל בית החזה כדי לגשת ללב באמצעות מספריים ומלקחיים.מחדירים קטטר תוך ורידי מחדר הלב השמאלי לכיוון אבי העורקים וחותכים את האורקל הימני. לאחר מכן, התחל את הזלוף עם 100 מיליליטר של 0.9% מלח רגיל עד שהדם היוצא מהאורקל הימני ברור. לאחר מכן להמשיך להחדיר עם 250 עד 300 מיליליטר של 4% paraformaldehyde ב 0.1 חיץ פוספט טוחן או PB pH 7.4 במשך 10 דקות.לאחר הזלוף, הסר את העור של הגפה האחורית הדו-צדדית באמצעות להב כירורגי וחשוף את העצב הסיאטי הדו-צדדי ואת שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי. נתחו את שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי הדו-צדדי בזהירות מהגפה האחורית באמצעות להב והניחו את השריר כולו ב-10 מיליליטרים של 4% פרפורמלדהיד. לאחר שעתיים, הסר את השריר מהתמיסה והגן עליו בהקפאה ב -10 מיליליטר של 25% סוכרוז ב- 0.1 PB טוחן ליום אחד בארבע מעלות צלזיוס.לאחר שהרקמה השרירית שקועה בתמיסת הסוכרוז, קבעו אותה בשלב הקפאה של מערכת מיקרוטום הזזה באמצעות מדיום חתך קפוא. פורסים את השריר אופקית לאורך הציר הארוך של השריר בעובי של 80 מיקרון. באמצעות מברשת, מניחים שבעה קטעי קריו לכל באר בצורה מסודרת בצלחת תרבית של שש בארות עם 10 מיליליטרים של 0.1 PB טוחן. לצורך צביעה פלואורסצנטית, יש לדוג ארבעה חלקים לכל באר עם 1.5 מיליליטרים של PB טוחן 0.1 המכיל 75 מיקרוליטרים של 10% Triton X 100 ו-45 מיקרוליטרים של סרום חמור רגיל על שייקר מסלולי ב-20 סל"ד.לאחר 30 דקות, מעבירים את החלקים ל-1.5 מיליליטרים של תמיסה מעורבת של נוגדנים ראשוניים המכילים נימה אנטי-נוירוגרפית של ארנב 200, טרנספורטר אצטילכולין נגד שלפוחית עזים ב-0.1 PB טוחן, בסרום חמור רגיל של 1%, ו-0.5%Triton X 100 ודגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הקטעים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד ב-0.1 PB טוחן על שייקר מסלולי ב-20 סל"ד. לאחר הדחיפה האחרונה, דגירו את הקטע בתמיסה מעורבת של נוגדנים משניים המכילים חמור נגד ארנב AF 488 וחמור נגד עזים AF 546, כמו גם את הסמנים הביולוגיים של רעלן אלפא בונגארו AF 647 ופאלואידין 350 המכילים 0.1 M PB המכילים 1%נסיוב חמור רגיל ו-0.5 טריטון x 100 למשך שעה, הגנה עליהם מפני אור.לאחר הדגירה, לשטוף את החלקים ב- PB ולהרכיב אותם על שקופית מיקרוסקופ. יש למרוח את הכיסוי על החלק באמצעות 50% גליצרין במים מזוקקים. שימו לב ודמיינו את הדגימה באמצעות מערכת הדמיה ממוקדת המצוידת בעדשה סובייקטיבית של 20 x עם מפתח צמצם מספרי של 0.75 ועדשה של 40 x עם מפתח צמצם מספרי של 0.95.להדמיה פלואורסצנטית מרובה, קבעו את אורכי הגל של העירור והפליטה של כל סמן ביולוגי כמתואר בכתב היד של הטקסט. הגדר את הרזולוציה של לכידת תמונה ל- 640 על ידי 640 פיקסלים. לאחר מכן, הגדר את מישור המוקד של ההתחלה והסיום.הגדר את גודל הצעד למיקרון אחד או שניים. לאחר מכן בחר תבנית עומק, לכידת תמונה וסדרת Z. עבור תמונות ההגדלה הנמוכה יותר ב- 20 X, צלם תמונות ערימה של 40 Z בגודל של שני מיקרון באמצעות חור סיכה של 105 מיקרון.בחר את מצב ההקרנה או הטופוגרפיה ואת הקרנת העוצמה מעל ציר Z כדי לשלב את כל התמונות במיקוד אחד. עבור תמונות ההגדלה הגבוהה יותר ב- 40 X, צלם תמונות ערימה של 80 Z בגודל צעד מיקרון אחד עם זום המוגדר לשניים וחור סיכה של 105 מיקרון. שלב את כל התמונות במוקד אחד.שחזרו את התמונות בתבנית התלת-ממדית באמצעות מערכת עיבוד התמונה. המתאם המרחבי הייצוגי של שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי עם נימה עצבית 200 סיבי עצב חיוביים, טרנספורטר אצטילכולין שלפוחיתי חיובי טרום סינפטי, קולטני אצטילכולין חיוביים לרעלן אלפא בונגארו, קולטני אצטילכולין פוסט-סינפטיים חיוביים של אלפא בונגארו, תאי שוואן פריזינפטיים חיוביים S100, סיבי שרירים חיוביים פאלואידין וגרעיני תאיים המסומנים ב- DAPI מודגמים כאן. הנוירופילמנט 200 סיבי עצב חיוביים רץ בצרורות.סיבי עצב אלה נתנו ענפים למסוע האצטילכולין השלפוחיתי מסופים קדם-סינפטיים חיוביים, שיצרו קשר מראה עם קולטני האצטילכולין החיוביים לרעלן אלפא בונגארו. בנוסף, התאים החיוביים של S100 perisynaptic Schwann זוהו סביב הנוירופילמנט 200 סיבי עצב חיוביים קרוב לטרמינלים הטרום-סינפטיים. המתאם המרחבי הוצג עוד יותר בתבנית תלת-ממדית המציגה את המאפיינים המורפולוגיים המפורטים של הצומת הנוירומוסקולרי מנקודות מבט שונות.על מנת לצפות בהדמיה רבה יותר במקטעים שריריים, חשוב לפרוס את השריר אופקית לאורך הציר הארוך בעובי של 80 מיקרון.

הדמיה של המאפיינים המורפולוגיים של צומת נוירומוסקולרי בשריר גסטרוקנמיוס מדיאלי של חולדה

Abstract