המחקר מומן על ידי מענקי DZHK 81Z0600207 (JH, PS ו- DM) ו- 81X2600253 (AD ו- TS).
המחברים רוצים להודות לקלאודיה פאני, מיי-פינג וו ומתיאס סמיש על תמיכתם בהכנת הסט-אפים, כמו גם על התחזוקה השוטפת של גידול הרקמות.

איסוף הרקמות לניסויים המתוארים כאן אושר על ידי ועדות הביקורת המוסדיות של אוניברסיטת מינכן ובוכום של אוניברסיטת הרוהר. המחקרים נערכו על פי הנחיות הצהרת הלסינקי. המטופלים נתנו את הסכמתם מדעת בכתב לפני איסוף הרקמות.
1. רכישת רקמות
<ol><li>להשיג רקמה אנושית מחולים שעברו ...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

בעבר, מחקר הלב וכלי הדם עשה התקדמות רבה בטיפוח של קרדיומיוציטים. עם זאת, הטיפוח התלת-ממדי של קרדיומיוציטים עם גיאומטריה שלמה עדיין אינו מבוסס היטב. בהשוואה לפרוטוקולים קודמים שיושמו עבור גידול ex vivo של רקמת שריר הלב, הפרוטוקול שתיארנו כאן דומה יותר לסביבת in vivo של הרקמה. יתר על כן, ה?...

בעשור האחרון, גידול במבחנה של תאי שריר הלב עשה התקדמות רבה, החל מטכניקות דו-ממדיות ותלת-ממדיות (תלת-ממדיות) וכלה בשימוש באורגנואידים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שהתמיינו למיוציטים לבביים 1,2,3. גידולי Ex vivo ותאים ראשוניים הראו שהם בעלי ערך רב, במיוחד עבור מחקרים גנטיים ופיתוח תרופות 4,5,6. שימוש ברקמות אנושיות משפר את הערך התרגומי של התוצאות. עם זאת, טיפוח תלת-ממדי ארוך טווח של רקמות שריר הלב עם גיאומטריה שלמה אינו מבוסס היטב. הגיאומטריה השלמה היא תכונה מרכזית לחיקוי תנאי in vivo, שכן תפקוד לב תקין, תקשורת בין תאים שונים, כמו גם אינטראקציות בין מטריצת תאים הם תנאים מוקדמים. טיפוח רקמות שריר הלב עבר שלבים שונים של התפתחות. אחוזי ההצלחה והיציבות של גידול רקמות שריר הלב ex vivo היו בתחילה נמוכים למדי, אך הגישות האחרונות הניבו תוצאות מבטיחות 7,8,9,10,111.
מבין אלה, Fischer et al. היו הראשונים שהדגימו כי ניתן לשמור על כדאיות וביצועים מתכווצים של רקמת שריר הלב האנושית בטיפוח תאי ex vivo במשך שבועות רבים7. הטכניקה שלהם התבססה על פרוסות רקמה דקות שנחתכו מתוך שריר הלב האנושי, שהורכבו בתאי גידול שפותחו לאחרונה וסיפקו תנאים ביומכניים מוגדרים וגירוי חשמלי מתמשך. שיטת טיפוח זו דומה מאוד לתפקוד in vivo של רקמת שריר הלב, ושוכפלה על ידי מספר קבוצות מחקר עצמאיות 2,12,13,14,15. חשוב לציין כי התאים ששימשו את Fischer et al. אפשרו גם רישום רציף של כוחות מפותחים במשך עד 4 חודשים, ובכך פתחו הזדמנויות חסרות תקדים למחקר פיזיולוגי ופרמקולוגי על שריר הלב האנושי השלם7.
טכניקות דומות פותחו באופן עצמאי על ידי קבוצות אחרות ויושמו על בני אדם, חולדות, חזירים וארנבים שריר הלב 7,10,11. Pitoulis et al. פיתחו לאחר מכן שיטה פיזיולוגית יותר, המשחזרת את יחס הכוח-אורך הרגיל במהלך מחזור התכווצות, אך פחות מתאימה לניתוח בתפוקה גבוהה16. ככזו, ניתן לראות את הגישה הכללית של גידול ביומימטי כצעד נוסף לצמצום, עידון והחלפה (3R) של ניסויים בבעלי חיים.
עם זאת, ניצול של פוטנציאל זה דורש נהלים סטנדרטיים, ניתוחי תוכן גבוהים ורמת תפוקה גבוהה. אנו מציגים טכניקה המשלבת חיתוך אוטומטי של שריר הלב האנושי החי עם תחזוקה במבחנה במערכת גידול ביומימטית שהפכה לזמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים). עם הגישה המוצעת, מספר הפרוסות הבודדות שניתן ליצור מדגימה אחת של שריר הלב הטרנסמורלי מוגבל רק על ידי זמן העיבוד. דגימה בגודל ובאיכות מספיקים (3 ס"מ על 3 ס"מ) מניבה לעתים קרובות 20-40 פרוסות רקמה שנחתכות בנוחות עם ויברטום אוטומטי. פרוסות אלה ניתן לשים בתאי טיפוח השייכים למערכת. התאים מאפשרים גירוי חשמלי, שאת הפרמטרים שלו ניתן לווסת (כלומר, משך הדופק, הקוטביות, הקצב והזרם), כמו גם את התאמת העומס לפני ואחרי, באמצעות חוטי קפיץ בתוך התאים. הכיווץ של כל פרוסה נרשם מתנועה של מגנט קטן המחובר לחוט קפיץ ומוצג כגרף הניתן לפרשנות. ניתן להקליט נתונים בכל עת ולנתח אותם באמצעות תוכנה זמינה באופן חופשי. מלבד הקצב הבסיסי הקבוע, ניתן לבצע פרוטוקולים מתוזמנים כדי להעריך באופן פונקציונלי את תקופת העקשנות שלהם, את סף הגירוי, את העוצמה שלאחר ההשהיה ואת הקשר בין הכוח לתדר.
טיפוח ביומימטי ארוך טווח זה של פרוסות שריר הלב מרובות מלב בודד סולל את הדרך למחקר ex vivo עתידי הן ברקמות אנושיות והן ברקמות של בעלי חיים, ומאפשר את הסינון להשפעות תרופתיות טיפוליות וקרדיוטוקסיות ברפואת הלב וכלי הדם. זה כבר יושם על גישות ניסיוניות שונות 2,12,13,15. כאן, אנו נותנים תיאור מפורט שלב אחר שלב של הכנת רקמות אנושיות ומספקים פתרונות לבעיות טיפוח שנתקלים בהן לעתים קרובות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

גידול קרדיומיוציטים ראה מספר עצום של התפתחויות, החל מגידול תאים דו-ממדי (דו-ממדי) וכלה באורגנואידים שמקורם ב-iPSC. בשנת 2019 הודגמה דרך ex vivo לטפח פרוסות שריר הלב המתקבלות מדגימות לב אנושיות, תוך התקרבות למצב in vivo של התכווצות שריר הלב. דגימות אלה מקורן בעיקר בהשתלות לב או בהצבת מכשירי סיוע לחדר שמאלי. באמצעות ויברטום ומערכת טיפוח שפותחה במיוחד, פרוסות בעובי 300 מיקרומטר ממוקמות בין חוט קבוע לחוט קפיץ, ומאפשרות טיפוח יציב וניתן לשחזור במשך מספר שבועות. במהלך הטיפוח, הפרוסות מגורות באופן רציף על פי הגדרות בודדות. ניתן להציג ולתעד התכווצויות בזמן אמת, וניתן ליישם בקלות חומרים פרמקולוגיים. ניתן לתזמן ולבצע פרוטוקולי גירוי המוגדרים על-ידי המשתמש כדי להעריך פרמטרים חיוניים של כיווץ כמו פוטנציה לאחר ההשהיה, סף הגירוי, יחסי כוח-תדר ותקופת עקשן. יתר על כן, המערכת מאפשרת הגדרה משתנה לפני ואחרי העומס לטיפוח פיזיולוגי יותר.
כאן, אנו מציגים מדריך שלב אחר שלב כיצד ליצור טיפוח מוצלח לטווח ארוך של פרוסות שריר הלב של החדר השמאלי האנושי, באמצעות פתרון גידול ביומימטי מסחרי.

הכיווץ של פרוסות שריר הלב הוצג על מסך המחשב לאחר החדרת תא הטיפוח למחבר המתאים לו (איור 3). התכווצות פרוסות שריר הלב האנושיות החלה מיד עם הגירוי. הפרוסות התרכזו יתר על המידה במשך 5-10 דקות. זה נראה לעין כעלייה של כוחות דיאסטולים, שנגרמו על ידי התכווצות טוניקה של שברי רקמה פגומים....

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

אנו מציגים פרוטוקול לטיפוח ex vivo של רקמת שריר הלב החדרית האנושית. זה מאפשר ניתוח מפורט של כוח התכווצות וקינטיקה, כמו גם את היישום של pre- ו- afterload כדי לחקות את הסביבה הפיזיולוגית in vivo מקרוב יותר.

הכנת רקמת שריר הלב האנושית לטיפוח ארוך טווח

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לטפח פרוסות רקמה של החדר השמאלי האנושי ex vivo בתא ביומימטי. היישום של עומסים לפני ואחרי משפר את הדמיון של הסביבה הפיזיולוגית. טכניקה זו מאפשרת רישום רציף של התכווצות רקמות.פרוטוקולי גירוי המוגדרים על-ידי המשתמש מאפשרים הערכה של פרמטרי כיווץ חיוניים כמו פוטנציה לאחר הפסקה, סף גירוי, יחס כוח-תדר ותקופה עקשן. הטיפוח ארוך הטווח של פרוסות שריר הלב, באמצעות מערך זה, יסלול את הדרך למחקר ex vivo עתידי, ויקל על הקרנה זו להשפעות תרופתיות טיפוליות וקרדיוטוקסיות ברפואת הלב וכלי הדם. כדי להתחיל, להטביע את תאי הטיפוח ואלקטרודות הגרפיט לליטר אחד של תמיסת איזופרופנול של 10% ולהתסיס בן לילה.למחרת, מעבירים את התאים לתמיסת איזופרופנול של 100% למשך 3 דקות, ואז מאפשרים לתאים ולאלקטרודות הגרפיט להתייבש באוויר מתחת למכסה זרימה למינרי. חבר לוח מעגלים לכל תא בהתאם למיקומים הזמינים על הנדנדה. מניחים שתי אלקטרודות גרפיט על לוח המעגלים בהתאם להוראות היצרן, ואז מניחים מכסה צלחת פטרי באורך 35 מילימטרים על התא כדי למנוע זיהום.לאחר מכן, מלאו את מגש החיתוך עד 90 עד 95% עם מאגר חיתוך. מעבירים את דגימת הרקמה לצלחת פטרי באורך 100 מילימטרים במילוי חיץ קר, ומניחים את המנה על צלחת קירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר את הטרבקולה אנדוקרדיאלית על ידי החזקת אנדוקרדיום בפינצטה, ולאחר מכן השתמש במספריים כדי לחתוך כ -3 מילימטרים של רקמת אנדוקרדיאל.קבעו את דגימת הרקמה החתוכה, הצד האנדוקרדיאלי עד לתיקון גומי בגודל 2 על 2 ס"מ באמצעות ארבע מחטים בגודל 0.9 על 70 מילימטר 20 מילימטרים המקובעות במצב מרובע. ודאו שהקצה האלכסוני של כל קצה מחט מצביע פנימה, משפר את הקיבוע ומונע נזק לשריר הלב. באמצעות אזמל, חותכים את כל הרקמה העודפת מחוץ לארבעת ריבועי המחט.באמצעות פינצטה, מניחים את הדגימה הגזומה על פיסת רקמה סטרילית למשך 10 שניות כדי להסיר עודפי חיתוך. לאחר מכן, הסר את מזרק האגרוז מאמבט המים והטביע את הדגימה באגרוס. תנו לאגרוזה להתמצק במשך חמש דקות על צלחת קירור.הצד האנדוקרדיאלי של המדגם חייב להיות גלוי באגרוז. באמצעות פינצטה, מניחים את הצד האפיקרדיאלי של הדגימה הכלולה באגרוז על גבי האזור המודבק, ואז לוחצים בעדינות על הדגימה המכילה אגרוז מלמעלה עם כלי קהה מבלי לחתוך או לפגוע באגרוז. תנו לדבק להתמצק למשך דקה אחת.הגדר את משרעת הרטט ל-1 מילימטר, את מהירות החיתוך הראשונית ל-0.07 מילימטר לשנייה ואת עובי הפרוסה ל-300 מיקרון. לאחר חיבור מערכת הטיפוח למחשב, הפעל את התוכנה המתאימה. הגדר את מהירות הנדנדה ל-60 סל"ד והגדר מראש את פרמטרי הגירוי.עבור פרוסות לב אנושיות, הגדר את הגירוי הסטנדרטי לדחפים דו-פאזיים עם 50 מילימפ או זרם המורכב מזרם חיובי של 3 אלפיות השנייה, הפסקה של אלפית השנייה ופולס של 3 אלפיות השנייה של זרם הפוך בקצב קצב של 30 פעימות לדקה או bpm, ולאחר מכן בדוק את מחווני האלקטרודה של התוכנה וודא שהאלקטרודות של תאי הטיפוח פועלות כראוי. באמצעות פינצטה, להפריד את האגרוז מן הרקמה. הימנעו מלגעת ברקמה וטפלו בה בזהירות, שכן כל פגיעה ברקמה תפחית את אחוזי ההצלחה של הטיפוח.כדי לחבר שני משולשי פלסטיק לדגימה, הניחו מיקרוליטר אחד של דבק על מכסה צלחת פטרי סטרילי. השתמשו בפינצטה מחוברת כדי להרים משולש פלסטיק אוטומטי אחד. טבלו במהירות את הקצה הקדמי של המשולש בדבק והדביקו את המשולש על הדגימה בניצב ליישור הקרדיומיוציטים.חזור על הפעולה עבור המשולש השני. בעזרת אזמל, חותכים את הרקמה העולה על רוחב המשולש ומניחים את הפרוסה עם שני המשולשים המותקנים בחזרה למגש החיתוך המכיל מאגר חיתוך. הסר את תא הטיפוח המלא הבינוני מהחממה.בחר פרוסה אחת מוכנה והכנס אותה לתא על-ידי חיבור משולש אחד לכל סיכה. התאם את המרחק בין פיני ההרכבה לגודל המדגם. ודא שהמדגם שקוע בתווך.לאחר הנחת המנה על הנדנדה, הקטן את הטעינה מראש על ידי סיבוב בורג הכוונון נגד כיוון השעון עד שבסיס הגרף המתאים על מסך המחשב אינו משתנה עוד, ולאחר מכן הגדל בזהירות את הטעינה מראש או המתח על ידי סיבוב בורג הכוונון בכיוון השעון. עבור תאים עם קשיחות גבוהה, המשך עד שקו הבסיס המתאים בגרף גדל ב- 1, 000 ל- 1, 200 יחידות המתאימות לטעינה מראש של מילינווטון אחד. לאחר הכנת מדיום הטיפוח הטרי, מחממים מראש את המדיום באמבט מים או באינקובטור אוויר חם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 45 דקות.מוציאים את המדיום מהתא, ומשאירים כ-0.8 מיליליטרים בתא, ואז מוסיפים 1.6 מיליליטרים של מדיום טרי לאותו תא, מה שהופך את הנפח הכולל של בינוני ל-2.4 מיליליטרים לכל תא. לבסוף, הניחו את הכיסוי של החדר בחזרה והניחו את תא הטיפוח במקומו המתאים. הקריאה של כיווץ חמש פרוסות שריר הלב במהלך גירוי טיפוסי כללה ארבעה חלקים נפרדים של פוטנציה לאחר ההשהיה, סף הגירוי, יחס כוח-תדר ותקופת עקשן.בהשוואה לשליטה, כוח הכיווץ של הפרוסות שטופלו באנטגוניסטים של סידן, ניפדיפין וקלציצפטין, פחת תוך 10 דקות. לעומת זאת, אגוניסט תעלת הסידן המגודר במתח, Bay-K8644, הגדיל את כוח ההתכווצות. הפוטנציה לאחר ההפסקה של פרוסות הבקרה והפרוסות המטופלות הוערכה עבור שחרור הסידן התוך-תאי מהרשתית הסרקופלסמית.פרוסת הבקרה לא הראתה שינויים כלשהם. בנוכחות קלציצפטין וניפדיפין, עיכוב תעלות הסידן מסוג L הוביל לפוטנציה של ההתכווצות הראשונה לאחר הפסקה של 50 שניות, המשקפת תרומה יחסית גבוהה יותר של שחרור סידן תוך תאי להתכווצות מוחלטת. ההשפעה ההפוכה נצפתה עם Bay-K8644, אשר מגרה את כניסתו של סידן חוץ-תאי דרך תעלות הסידן מסוג L.בניתוח יחסי כוח-תדר, לא נצפה שינוי בפרוסת הבקרה. הטיפול בקלציצפטין לא שינה את יכולתה של הפרוסה לעקוב אחר הגירויים עם עליית תדירות הגירוי בעת השוואת הנתונים לפני ואחרי הטיפול. בהשוואה לקלציצפטין, ניפדיפין מנע עלייה בהתכווצות בשיעורי קצב גבוהים יותר והפחית את קצב הלכידה המרבי ב-80 פעימות לדקה.עם Bay-K8644 נצפה כוח כיווץ מוגבר בתדרי גירוי נמוכים מאוד. עם זאת, בתדרים הגבוהים מ-50 פעימות לדקה, כוח ההתכווצות היה נמוך יותר מאשר במצב שלפני הטיפול. יש להעביר במהירות רקמה שנכרתה ל-4 מעלות קרדיופלגיה.לאחר החיתוך, משולשי פלסטיק חייבים להיות מחוברים בניצב לכיוון הסיבים. הטעינה מראש לא תעלה על 1500 מילינווטון. תרבית פרוסות ביומימטית יכולה לסייע לחוקרים להשתמש במניפולציות גנטיות, כמו גם בטיפולים מבוססי תאים לחקר התחדשות ותיקון בשריר הלב האנושי הבוגר.

הכנת רקמת שריר הלב האנושית לטיפוח ארוך טווח

Abstract