Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIA/NIH R01AG070255 e R01AG073133 à AL. Agradecemos também ao Centro de Pesquisa da Doença de Alzheimer Irvine da Universidade da Califórnia (UCI-ADRC) por fornecer o tecido humano mostrado neste manuscrito. O UCI-ADRC é financiado pela concessão do NIH/NIA P30 AG066519.

Todas as pesquisas são realizadas em conformidade com as diretrizes institucionais e aprovadas pelo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia Irvine (IACUC-1998-1388) e do Ramo Médico da Universidade do Texas (IACUC-1803024). O córtex temporal de um cérebro não-Alzheimer (da mulher, 74 anos, intervalo pós-morte 2,8 h) e um cérebro de D.C.(feminino, 74 anos, intervalo pós-morte 4,5 h) foram fornecidos pelo Centro de Pesquisa da Doença de Alzheimer irvine da Universidade da ...

A análise de complexos proteicos nativos do cérebro humano é necessária para entender processos homeostáticos e patológicos em distúrbios cerebrais e desenvolver estratégias terapêuticas para prevenir ou tratar doenças. Assim, os bancos cerebrais contendo amostras congeladas instantâneas são uma fonte inestimável de uma grande e principalmente inexplorada riqueza de informações fisiológicas29,30. Uma preocupação inicial para o uso do tecido pós...

Distúrbios neurodegenerativos afetam grande parte da população. Embora suas consequências devastadoras sejam bem conhecidas, a ligação entre as alterações funcionais dos receptores neurotransmissores, que são críticas para a função cerebral, e sua sintomatologia ainda é mal compreendida. A variabilidade inter-individual, a natureza crônica da doença e o início insidioso dos sintomas são apenas algumas das razões que atrasaram a compreensão das muitas doenças cerebrais onde os desequilíbrios químicos estão bem documentados 1,2. Modelos animais geraram informações inestimáveis e expandiram nosso conhecimento sobre os mecanismos subjacentes à fisiologia e à fisiopatologia em sistemas conservados evolutivos; no entanto, várias diferenças entre roedores e humanos impedem a extrapolação direta da função receptora de modelos animais para o cérebro humano3. Assim, os esforços iniciais para estudar receptores humanos nativos foram desenvolvidos pelo laboratório de Ricardo Miledi utilizando tecido removido cirurgicamente e amostras congeladas. Esses experimentos iniciais utilizaram membranas inteiras que incluem receptores sinápticos neuronais e extra-sinápticos, bem como receptores neurotransmissores não neuronais, e embora forneçam informações importantes sobre estados doentes, há uma preocupação de que a mistura de receptores complica a interpretação dos dados 4,5,6,7. É importante ressaltar que as sinapses são o principal alvo em muitas doenças neurodegenerativas 8,9; portanto, ensaios para testar as propriedades funcionais das sinapses afetadas são fundamentais para obter informações sobre mudanças relevantes para a doença que afetam a comunicação sináptica. Aqui, descreve-se uma modificação do método original: microtransplantação de membranas sinápticas (MSM), que se concentra na caracterização fisiológica de preparações de proteína sináptica enriquecida e foi aplicada com sucesso para estudar sinapttos de ratos e humanos 10,11,12,13,14,15 . Com essa metodologia, é possível transplantar receptores sinápticos que antes trabalhavam no cérebro humano, embutidos em seus próprios lipídios nativos e com sua própria coorte de proteínas associadas. Além disso, como os dados do MSM são quantitativos, é possível usar esses dados para se integrar com grandes conjuntos de dados proteômicos ou sequenciamento10.
É importante notar que muitas análises farmacológicas e biofísicas de receptores sinápticos são feitas em proteínas recombinantes16,17. Embora essa abordagem forneça uma melhor visão das relações estrutura-função dos receptores, não pode fornecer informações sobre complexos receptores multimédicos encontrados nos neurônios e suas mudanças na doença. Portanto, uma combinação de proteínas nativas e recombinantes deve fornecer uma análise mais abrangente dos receptores sinápticos.
Existem muitos métodos para preparar sinapstos 10,11,12,13,14,15 que podem ser ajustados para os requisitos de um laboratório. O protocolo começa com a suposição de que as preparações enriquecidas sinaptosômicas foram isoladas e estão prontas para serem processadas para experimentos de microtransplante. No laboratório, o método Syn-Per é usado seguindo as instruções do fabricante. Isso é feito por causa da alta reprodutibilidade em experimentos eletrofisiológicos10,11. Há também literatura abundante explicando como isolar xenopus oócitos18,19, que também podem ser comprados prontos para injeção20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>For Microinjection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5&#34; Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well, flat bottom Tissue Culture Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown type micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Dish</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>08-772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>O121-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Industrial Netting</td>
			<td>WN0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-000-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14-841-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaning bath</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>FS20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis frogs</td>
			<td>Xenopus 1</td>
			<td>4217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Two Electrode Voltage clamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B200-116-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Any PC computer or laptop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-pass Bessel Filter</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>LPF-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-000-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two electrode voltage clamp workstation</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TEV-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink 8.2 Perfusion Controller</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>SKU:01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WInEDR Free software</td>
			<td>University of Strathclyde Glasgow</td>
			<td>https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X Series Multifunction DAQ</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI USB-6341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainic acid</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafree-0.1 &#181;m MC filter,</td>
			<td>Amicon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microtransplantation of synaptic membranes to reactivate human synaptic receptors for functional studies

Receptores ionotrópicos excitatórios e inibitórios são os principais portões de fluxos de íons que determinam a atividade de sinapses durante a comunicação neurológica fisiológica. Portanto, alterações em sua abundância, função e relações com outros elementos sinápticos têm sido observadas como uma grande correlação de alterações na função cerebral e comprometimento cognitivo em doenças neurodegenerativas e transtornos mentais. Entender como a função dos receptores sinápticos excitatórios e inibitórios é alterada pela doença é de fundamental importância para o desenvolvimento de terapias eficazes. Para obter informações relevantes sobre doenças, é importante registrar a atividade elétrica de receptores neurotransmissores que permanecem funcionais no cérebro humano doente. Até agora esta é a abordagem mais próxima para avaliar alterações patológicas na função dos receptores. Neste trabalho, é apresentada uma metodologia para realizar a microtransplantação de membranas sinápticas, que consiste em reativar membranas sinápticas a partir de tecido cerebral humano congelado que contém receptores humanos, por sua injeção e fusão posterior na membrana de oócitos Xenopus laevis . O protocolo também fornece a estratégia metodológica para obter respostas consistentes e confiáveis dos receptores α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionic ácido (AMPA) e γ-aminobutírico (GABA), bem como novos métodos detalhados que são usados para normalização e análise rigorosa de dados.

Poucas horas após a injeção, as membranas sinápticas, carregando seus receptores neurotransmissores e canais de íons, começam a se fundir com a membrana plasmática oócica. A Figura 1 mostra gravações de receptores AMPA e GABAA microtransplantados em oócitos xenopus. Para a maior parte da análise, as respostas de dois ou três oócitos por amostra foram medidas, utilizando dois ou três lotes de oócitos de diferentes sapos, para um total de seis a nove oócito...

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Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

O protocolo demonstra que, realizando microtransplante de membranas sinápticas em oócitos Xenopus laevis , é possível registrar respostas consistentes e confiáveis de receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropônico e receptores de ácido γ-aminobutírico.

Microtransplantação de Membranas Sinápticas para Reativar Receptores Sínpticos Humanos para Estudos Funcionais

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Distúrbios neurodegenerativos e de saúde mental resultam de mudanças na comunicação sináptica. Eventos multifatoriais mudam receptores sinápticos de maneiras que não entendemos completamente. A microtransplantação de membranas sinápticas fornece uma visão dessas alterações.A principal vantagem dessa técnica é a possibilidade de registrar a atividade de receptores cerebrais nativos trabalhando no cérebro humano e, portanto, representar as doenças que estamos estudando. Receptores sinápticos são os principais alvos da medicina que regula a atividade elétrica do cérebro, mas entendendo como esses receptores mudam, melhores terapias restaurando sua funcionalidade podem ser desenvolvidas. Este método tem sido aplicado com sucesso a diferentes espécies, desde insetos, peixes, mamíferos, mas também pode ser aplicado a receptores de membrana fora do cérebro, por exemplo, músculos e tumores.As possibilidades são amplas. Cortar agulhas de injeção é complicado. Muito pequeno pode prevenir a injeção de proteína, e dois grandes podem matar a célula.Ajuda a usar uma medida consistente, como a borda de uma lâmina de barbear. Comece por sonicar as amostras selecionadas preparadas da região cerebral humana de interesse três vezes em um banho com gelo molhado flutuante. Use cinco ciclos de segundo cada vez e espere por um minuto no gelo molhado entre os ciclos.Coloque um microliter da amostra sobre o termoplástico e faça um recuo na superfície, se necessário, antes da colocação da amostra para evitar o movimento da amostra. Use os botões do manipulador segurando o nanoinjetor para posicionar a agulha e mova-a em direção à amostra a ser preenchida. Uma vez que a ponta da agulha esteja na amostra, pressione e segure o botão de preenchimento até que a amostra suficiente seja colhida.Cerca de 0,5 amostra de microliter é necessária para 10 oócitos. Use os botões para mover a agulha do nanoinjetor de volta para a posição mais alta. Penetre o oócito logo abaixo da superfície com uma agulha, não mais profunda, e use o pedal do pé para injetar a amostra.Espere cerca de dois a três segundos. Após a injeção bem sucedida, a célula se expandirá. Use os botões no manipulador para sair da célula.Mova a placa de Petri para que o próximo oócito esteja alinhado com a agulha. Repita o processo até que o número desejado de oócitos no prato tenha sido injetado, em seguida, retraia o nanoinjetor à sua posição original e remova a agulha. Certifique-se de que um poço de oócitos seja deixado sem injeção para ser usado como controle.Ligue todos os equipamentos usados para a gravação das correntes de íons, depois ligue o computador desktop e faça login na versão WinEDR 3.9.1. Certifique-se de que o programa está em execução e o registro está definido como Disc. Depois disso, defina a duração da gravação e limpe a opção Simulador.Para a seção de eletrodos de tensão, desligue a compensação da capacidade negativa. Defina o interruptor seletor de ganhos para 10 para a seção de eletrodo de banho e, em seguida, ajuste o interruptor de alternação de três posições, que seleciona o multiplicador de ganhos, para x1. As luzes LED indicarão a seleção multiplicadora de ganhos.Desligue o seletor do modo de fixação, coloque o controle de ganho dc e ajuste o controle de ganho para cerca de metade do loop aberto de largura de banda completa. Defina comandos para 40 milvolts, os controles de resarção para negativo e o multiplicador de escala para x2. Para o eletrodo atual, use o deslocamento VE para estabelecer uma referência zero, antes de empalar o oócito.Em seguida, abra o software WinEDR versão 3.9.1, vá para o menu superior e selecione Arquivo, seguido pelo Novo. Crie sua própria pasta e salve o arquivo. No menu principal, selecione Gravar, seguido de Gravar para Disco.Coloque as pontes de ágar nos respectivos orifícios circulares atrás da câmara de gravação, conectando os poços para os eletrodos usados como referência de terra na câmara de gravação. Adicione a solução de trabalho do Ringer 1x à válvula de perfusão correspondente. Abra a válvula até que a câmara de gravação esteja cheia de Solução ringer.Usando os manipuladores direito e esquerdo segurando os eletrodos, guie as agulhas de eletrodo para a câmara de gravação que está cheia de Solução de Ringer. Verifique a resistência de cada eletrodo zerando os botões de deslocamento VM e VE e, em seguida, pressionando os botões de teste de eletrodo. A resistência deve ser entre 0,5 a 3 megaohm.Se a resistência estiver fora do alcance, substitua-a usando novos microeletros. Em seguida, encha a câmara de gravação com a solução de Ringer fresca. Use uma pipeta de vidro para colocar um oócito não injetado ou micro transplantado no centro da câmara de gravação.Certifique-se de que o oócito é claramente visível sob o microscópio com o lado animal para cima. Guie o eletrodo para a Solução do Ringer até que toquem na membrana oócito. Fure suavemente a membrana oócito no lado animal com os dois eletrodos, e registe o potencial da membrana de repouso.Ligue o fluxo de solução do Ringer. Usando o Amplificador de grampo oócito, altere o modo para fixação de tensão lentamente, e ajuste a tensão de retenção para 80 milvolts. A corrente no monitor deve ser negativa, geralmente entre 0 e 0,4 microamperes.Vá para File, New e, em seguida, salve a gravação no software para criar um novo arquivo e salve a gravação. Pressione a Gravação seguida de Gravação para Disco para iniciar a gravação. Adicione informações relevantes ao arquivo usando o diálogo Mark Chart.Aplique agonistas para estimulação química abrindo as válvulas e perfundiando-as na câmara de gravação por 15 segundos. Uma vez concluída a gravação, gire o grampo de tensão para a posição de desligar e desligue a válvula de solução do Ringer. Remova o oócito e descarte seguir a política institucional para amostras de cérebro humano, em seguida, pare a gravação e salve o arquivo.Guarde uma cópia das gravações em uma unidade USB. A partir daí, abra o arquivo desejado para ser analisado. Para medir a resposta máxima DO AMPA e a resposta máxima do GABA A, primeiro, estabeleça um nível 0 ou linha de base, encontrando a linha vermelha e arraste-a para a corrente gerada pelo aplicativo Ringer ou linha de base.Uma vez estabelecido o nível 0, determine as medidas de resposta arrastando o cursor vertical verde para a parte desejada do rastreador gráfico. Foram registradas correntes de íons dos oócitos injetados com as membranas dos receptores sinápticos humanos. Os receptores AMPA foram ativados com 100 receptores de kainate micromolar, e receptores GABA A com um GABA milimolalar.Co-injeção das membranas filtradas do órgão elétrico do torpedo, rico em receptores de acetilcolina, e codificação cDNA para o receptor da linha GABA um no polo animal produziram principalmente dois grupos de oócitos, com base em suas respostas. Um grupo de oócitos teve grandes respostas à acetilcolina, mas nenhuma resposta a um micromolar GABA. Os oócitos em outro grupo tiveram respostas nulas ou baixas à acetilcolina, mas grandes respostas ao GABA.A imagem gráfica mostra a média mais menos erro padrão da média de pico de corrente no grupo um e no grupo dois. Um oócito no grupo dois tinha grandes respostas gaba e acetilcolina, sugerindo a ruptura do núcleo. Consequentemente, a distribuição das respostas foi distorcida a valores baixos, conforme observado pela diferença entre a média e a mediana da distribuição da corrente de membrana.Uma das causas dos oócitos de baixa resposta é que as membranas estão sendo injetadas e presas no núcleo do oócito. Respostas gaba e kainate de oócitos injetados nos polos animais ou vegetais com membranas não filtradas obtidas de um cérebro não-AD, e um cérebro de DA são mostrados aqui. Oócitos injetados perto do polo animal sem mirar o núcleo deram respostas maiores do que os oócitos injetados no polo vegetal, permitindo assim o estudo de amostras de tecido com um número muito baixo de receptores.Ao tentar este procedimento, monitore sempre o nível ringer. É sempre durante as gravações importantes que você vai acabar, e então ele vai usar o seu resultado, e morte do oócito, e perda de dados muito valiosos. Após este procedimento, podemos realizar cargas ocidentais para validar a presença dos receptores sinápticos, ou proteínas de interesse.Permite medir a excitação global para inibir as relações sinápticas em diferentes regiões cerebrais, e diferentes distúrbios cerebrais, permitindo fazer um teste direto na previsão teórica sobre as causas da doença.

Microtransplantação de Membranas Sinápticas para Reativar Receptores Sínpticos Humanos para Estudos Funcionais

Abstract