Yazarlar, doku örneği hazırlama konusunda uzman yardımı için Stony Brook Kanser Merkezi Histoloji Araştırma Çekirdeği'ne ve hayvan bakımı ve kullanımı konusunda yardım için Stony Brook Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Bölümü'ne teşekkür etmek istemektedir. Bu çalışma, Agnieszka B. Bialkowska'ya verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri DK124342 ve Dr. Vincent W. Yang'a verilen DK052230 hibeleriyle desteklenmiştir.

Tüm fareler, Stony Brook Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Bölümü'nde (DLAR) barındırıldı. Stony Brook Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC), hayvan denekleri içeren tüm çalışmaları ve prosedürleri onayladı. Hayvan denekleri içeren deneyler kesinlikle onaylanmış hayvan işleme protokolüne (IACUC #245094) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Fare suşları B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-CreER</e...

Bu protokol, sağlam ve tekrarlanabilir bir radyasyon hasarı modelini tanımlar. Yaralanma sonrası 7 gün boyunca bağırsak epitelindeki değişikliklerin hassas analizine izin verir. Önemli olarak, seçilen zaman noktaları yaralanmanın önemli aşamalarını yansıtır ve bağırsakta belirgin değişiklikler (yaralanma, apoptoz, rejenerasyon ve normalleşme aşamaları) ile karakterize edilir60. Bu ışınlama modeli, radyoterapi gören hastaların yaşadığı taklit yaralanmasının uygu...

İnsan bağırsak epiteli, tamamen düz1 yerleştirilirse yaklaşık yarım badminton kortunun yüzeyini kaplar. Bunun yerine, insanları bağırsaklarının içeriğinden ayıran bu tek hücre tabakası, bağırsakların yüzey alanını en üst düzeye çıkaran bir dizi parmak benzeri çıkıntı, villus ve girinti, kriptlere sıkıştırılır. Epitelin hücreleri bir kript-villus ekseni boyunca farklılaşır. Villus öncelikle besin emici enterositlerden, mukus salgılayan kadeh hücrelerinden ve hormon üreten enteroendokrin hücrelerden oluşurken, kriptler öncelikle savunma üreten Paneth hücreleri, aktif ve rezerv kök hücreler ve progenitör hücrelerdenoluşur 2,3,4,5. Ayrıca, bu hücrelerin altta yatan mezenkimal kompartmanın stromal ve immün hücreleri ve lümenin mikrobiyotası ile sahip olduğu çift yönlü iletişim, bağırsak homeostazını koruyan ve yaralanma sonrası iyileşme için kritik olan karmaşık bir etkileşim ağı oluşturur 6,7,8.
Bağırsak epiteli, insan vücudunda en hızlı kendini yenileyen dokudur ve 2-6 günlük bir devir hızı 9,10,11'dir. Homeostaz sırasında, lösin bakımından zengin tekrar içeren G-protein eşleşmiş reseptör 5'in (LGR5) ekspresyonu ile işaretlenmiş bağırsak kriptlerinin tabanındaki aktif kök hücreler (kript baz sütunlu hücreler), hızla bölünür ve diğer tüm bağırsak epitel soylarına farklılaşan progenitör hücreler sağlar. Bununla birlikte, yüksek mitotik oranları nedeniyle, aktif kök hücreler ve acil progenitörleri gama radyasyonu hasarına karşı özellikle hassastır ve ışınlama sonrası apoptozauğrarlar 5,12,13,14. Kayıpları üzerine, bağırsak kriptleri içindeki kök hücreleri ve kök olmayan hücreleri (progenitörlerin alt popülasyonu ve bazı terminal olarak farklılaşmış hücreler) aktivasyona uğrar ve bazal kript bölmesini yeniler, bu da daha sonra villusun hücre popülasyonlarını yeniden oluşturabilir ve böylece bağırsak epiteli15'i yenileyebilir. Soy izleme tekniklerini kullanan çok sayıda araştırma grubu, rezerv (sessiz) kök hücrelerin aktif kök hücrelerin kaybı üzerine rejenerasyonu destekleyebildiğini göstermiştir 13,16,17,18,19,20,21,22. Bu hücreler, polycomb kompleks protein 1 onkogen (Bmi1), fare telomeraz ters transkriptaz geni (mTert), Hop homeobox (Hopx) ve lösin bakımından zengin tekrar protein 1 geninin (Lrig1) varlığı ile karakterize edilir. Ek olarak, kök olmayan hücrelerin yaralanma üzerine bağırsak kriptlerini yenileyebildiği gösterilmiştir 23,24,25,26,27,28,29,30,31. Özellikle, salgı hücrelerinin ve enterositlerin progenitörlerinin yaralanma üzerine dediferansiyasyona uğradığı, kök benzeri hücrelere geri döndüğü ve bağırsak epitelinin yenilenmesini desteklediği gösterilmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, yaralanma üzerine kök benzeri özellikler kazanma kapasitesine sahip çoklu belirteçleri eksprese eden hücreleri tanımlamıştır (DLL +, ATOH1 +, PROX1 +, MIST1 +, DCLK1 + gibi)32,33,34,35,36. Şaşırtıcı bir şekilde, Yu ve ark. olgun Paneth hücrelerinin (LYZ +) bile bağırsak yenilenmesine katkıda bulunabileceğini göstermiştir37. Ayrıca, intestinal epitel hücrelerinin apoptozuna neden olmanın ve epitel bariyer fonksiyonunu bozmanın yanı sıra, ışınlama bağırsak florasının disbiyozu, immün hücre aktivasyonu ve pro-inflamatuar yanıtın başlatılması ve mezenkimal ve stromal hücrelerin aktivasyonu ile sonuçlanır38,39.
Gama radyasyonu, kanser tedavisinde, özellikle kolorektal tümörler için değerli bir terapötik araçtır40. Bununla birlikte, ışınlama, hücrelere zarar vererek bağırsak homeostazını önemli ölçüde etkiler ve bu da apoptoza yol açar. Radyasyona maruz kalma, hastanın iyileşmesini yavaşlatan çoklu pertürbasyonlara neden olur ve akut fazda mukozal yaralanma ve iltihaplanma ve ishal, idrar kaçırma, kanama ve uzun vadede karın ağrısı ile işaretlenir. Bu tezahür panoply, gastrointestinal radyasyon toksisitesi olarak adlandırılır. Ek olarak, transmural fibroz ve / veya vasküler sklerozun radyasyona bağlı ilerlemesi ancak tedaviden yıllar sonra ortaya çıkabilir38,41. Yaralanmanın kendisiyle eşzamanlı olarak, radyasyon bağırsak hücrelerinde rejenerasyonu başlatmaktan ve düzenlemekten sorumlu sinyal yollarını aktive eden bir onarım tepkisi indükler42. Radyasyona bağlı ince bağırsak hastalığı, diğer organlara (serviks, prostat, pankreas, rektum gibi) verilen pelvik veya abdominal radyoterapiden kaynaklanabilir41,43,44,45,46. Bu nedenle intestinal ışınlama hasarı önemli bir klinik konudur ve ortaya çıkan patofizyolojinin daha iyi anlaşılması, radyoterapi ile ilişkili gastrointestinal komplikasyonları hafifletmek için müdahalelerin geliştirilmesini ilerletebilir. Bağırsak epitelinin rejeneratif amacını radyasyondan ayrı olarak araştırmaya izin veren başka teknikler de vardır. Enflamasyonu ve daha sonra rejenerasyonu incelemek için transgenik ve kimyasal murin modelleri geliştirilmiştir47. Dekstran sodyum sülfat (DSS) bağırsakta iltihaplanmaya neden olur ve enflamatuar bağırsak hastalığınınkine benzer özelliklerin gelişmesine yol açar48. DSS tedavisinin pro-kanserojen bileşik azoksimetan (AOM) ile kombinasyonu, kolit ile ilişkili kanserin gelişmesine neden olabilir48,49. İskemi reperfüzyonuna bağlı yaralanma, bağırsak epitelinin rejeneratif potansiyelini incelemek için kullanılan başka bir yöntemdir. Bu teknik tecrübe ve cerrahi bilgi gerektirir50. Ayrıca, yukarıda belirtilen teknikler radyasyondan farklı yaralanma türlerine neden olur ve farklı rejenerasyon mekanizmalarının dahil olmasına neden olabilir. Ek olarak, bu modeller zaman alıcıdır, radyasyon tekniği ise oldukça kısadır. Son zamanlarda, bağırsak ve kolondan üretilen enteroidleri ve kolonoidleri kullanan in vitro yöntemler, bağırsak rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için radyasyon hasarı ile birlikte kullanılmıştır51,52. Bununla birlikte, bu teknikler modelledikleri organı tam olarak özetlemez53,54.
Sunulan protokol, tamoksifen tedavisini takiben, rezerv kök hücre popülasyonundan (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Bu model, rezerv kök hücreleri aktive etmek için yeterince önemli bağırsak hasarına neden olan 12 Gy toplam vücut ışınlamasını kullanırken, yaralanmadan sonraki 7 gün içinde bağırsak rejeneratif kapasitesinin daha sonra araştırılmasına izin verir55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

Bağırsak epiteli, tek bir hücre katmanından oluşur, ancak bağırsak kriptlerinin dibinde bulunan bağırsak kök hücrelerinin aktif çoğalmasıyla üretilen çok sayıda terminal farklılaşmış hücre türü içerir. Bununla birlikte, akut bağırsak hasarı olayları sırasında, bu aktif bağırsak kök hücreleri hücre ölümüne uğrar. Gama ışınlaması, terapötik olarak etkili olsa da, aktif kök hücre havuzunu tüketmenin yan etkisine sahip olan, yaygın olarak kullanılan bir kolorektal kanser tedavisidir. Gerçekten de, hastalar kısmen aktif kök hücre tükenmesi nedeniyle radyoterapi görürken sıklıkla gastrointestinal radyasyon sendromu yaşarlar. Bağırsak kriptlerindeki aktif bağırsak kök hücrelerinin kaybı, tipik olarak sessiz rezervli bağırsak kök hücrelerinden oluşan bir havuzu aktive eder ve sekretuar ve enterosit öncü hücrelerinin farklılaşmasını indükler. Bu hücreler için olmasaydı, bağırsak epiteli radyoterapi ve diğer büyük doku hakaretlerinden kurtulma yeteneğinden yoksun olurdu. Soy izleme teknolojilerindeki yeni gelişmeler, rejenerasyon sırasında hücrelerin aktivasyonunun, farklılaşmasının ve göçünün izlenmesine izin verir ve bunu bağırsakta incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu çalışma, radyasyon hasarını takiben fare bağırsak epiteli içindeki hücrelerin analizi için bir yöntem göstermeyi amaçlamaktadır.

Murin genetik soy takibi ile kombinasyon halinde 12 Gy toplam vücut ışınlamasının (TBI) kullanılması, bağırsaktaki radyasyon hasarının sonuçlarının kapsamlı bir analizine izin verir. Başlamak için, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP fareleri, bir Bmi1 + rezerv kök hücre popülasyonunda gelişmiş sarı floresan protein (EYFP) ekspresyonunu indükleyen tek bir tamoksifen enjeksiyonu aldı. Tamoksifen enjeksiyonundan iki gün sonra, farelere ışınlama veya sahte ışınla...

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Gastrointestinal sistem, radyoterapötik kanser tedavileri üzerine yaralanmaya karşı en hassas organlardan biridir. Aynı zamanda, bu tür hakaretleri takiben en yüksek rejeneratif kapasitelerden birine sahip bir organ sistemidir. Sunulan protokol, bağırsak epitelinin rejeneratif kapasitesini incelemek için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.

İyonlaştırıcı Işınlamaya Yanıt Olarak Bağırsak Epitelyal Rejenerasyonu

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Gama ışınlaması, kolorektal kanser için yaygın olarak kullanılan bir tedavidir. Terapötik olarak etkili olmasına rağmen, gastrointestinal sistem üzerinde olumsuz etkileri vardır. Sunulan protokol, radyasyon hasarından sonra rejenerasyon sırasında hücrelerin aktivasyonunu, farklılaşmasını ve göçünü incelemek için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.Bu protokol, sağlam ve tekrarlanabilir bir radyasyon hasarı modelini tanımlar. Önemli olarak, bu model yaralanma sonrası bağırsak hücresi kaderini izlemeye izin verir ve böylece spesifik hücre alt popülasyonunun rejeneratif kapasitesinin daha iyi anlaşılmasını sağlar. Bu teknik, gerçek zamanlı davranışı ve yaralanma sonrası hücrelerin çeşitli alt popülasyonlarının etkileşimini incelemek için farklı soy izleme hayvan modellerini kullanabilir.Bu protokoldeki küçük değişiklikler, radyasyon hasarı üzerine mikrobiyota ile farklı epitelyal, stromal ve immün hücre popülasyonları arasındaki ilişkilerin araştırılmasına izin vermelidir. Başlamak için, tamoksifen tozunu steril mısır yağında mikrolitre başına 30 mikrogramlık bir konsantrasyonda tekrar askıya alın. % 60 genlik ile 30 saniye açma-kapama döngülerinde üç dakika boyunca sonikasyon.Oda sıcaklığında bir saat boyunca karanlıkta dönerek karıştırın. Ardından, EdU tozuna steril DMSO ekleyerek EdU'yu hazırlayın. Toplam hacmin 1 / 5'ini ekleyin ve kalan steril ultra saf su hacmini yavaşça ekleyin.Tamamen çözündüğünde, aliquot ve 20 santigrat derecede saklayın. Sudaki %70 etanol, dört santigrat dereceye kadar soğutulmuş DPBS, Bouin'in fiksatif tamponu ve %10 tamponlu formalin gibi doku toplama ve fiksasyon için reaktifler hazırlayın. Daha sonra, bir fare diseksiyon kiti, Petri tabakları, 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 16 gauge gavage iğnesi ve histolojik kasetler gibi gerekli ekipmanı hazırlayın.Gama ışınlamasına maruz kalmadan iki gün önce, deney hayvanlarını tamoksifen enjeksiyonu için hazırlayın. Her hayvanı tartın ve gerekli dozu hesaplayın. Karın bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin.Daha sonra, Cre aracılı rekombinasyonu indüklemek için bir mililitrelik bir şırıngaya bağlı 27 gauge iğne kullanarak intraperitoneal olarak tek bir tamoksifen dozu uygulayın. Potansiyel tamoksifen toksisitesini dışlamak için önümüzdeki 48 saat boyunca hayvanları gözlemleyin. 48 saat sonra, hayvanları ışınlama odasına aktarın.Gama ışınlayıcısındaki numune odasını %70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin. Emici paspası ve hayvanları numune odasının içine yerleştirin. Kapağı yerleştirin ve odayı kapatın.Gama ışınlayıcısını, hayvanları 12 gri toplam vücut ışınlamasına maruz bırakacak şekilde programlayın. Ardından, anahtarı başlangıç konumuna getirin ve pozlamayı başlatmak için başlat tuşuna basın. Aktif pozlama süresi için odayı terk edin.Önceden ayarlanmış süre geçtikten sonra, makine otomatik olarak durur ve bip sesi çıkarmaya başlar. Anahtarı durma konumuna getirerek makineyi kapatın. Numune haznesini açın ve kapağı çıkarın.Hayvanları kafese aktarın ve numune odasını% 70 etanol ile dezenfekte edin. Hayvanları geleneksel barınma odasına geri aktarın ve tedavi sonrası durumlarını gözlemleyin. Hayvanların ağırlığını her gün izleyin.Planlanan ötenaziden üç saat önce, karın bölgesini dezenfekte edin ve farelere 28 gauge insülin şırıngası kullanarak 100 mikrolitre EdU stok çözeltisi ile intraperitoneal olarak enjekte edin. Hayvanı ötenazi yaptıktan sonra, proksimal bağırsakları ışınlama sonrası farklı zaman noktalarında toplayın. İnce bağırsağın proksimal kısmını diseke edin ve bağlı dokuları çıkarın.10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 16 gauge düz besleme iğnesi kullanarak dokuyu soğuk DPBS ile yıkayın ve dokuyu Bouin'in fiksatif tamponu ile sabitleyin. Bağırsakları uzunlamasına kesin ve Swiss-roll tekniğini kullanarak proksimal bağırsakları yuvarlayın. Dokuları% 10 tamponlu formalin içeren bir kaba histolojik bir kaset içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin.İnkübasyondan sonra, histolojik kasetleri% 70 etanol'e aktarın ve dokuyu parafine gömün. Gömdükten sonra, histolojik kasetleri en az bir saat boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ardından, bir mikrotom kullanarak beş mikron kalınlığında yatay bölümleri kesin.Doku bölümlerini 45 santigrat dereceye kadar ısıtılmış bir su banyosuna aktarın ve bölümleri yüklü slaytlara yerleştirin. Slaytları kuruması için gece boyunca oda sıcaklığında bir rafta bırakın. İnce bağırsak örneklerinin hematoksilin ve eozin görüntüleri, sıfır saatte homeostatik bir bağırsak epiteli gösterdi ve bunu apoptotik faz sırasında kript bölmelerindeki hücrelerin kaybı izledi.Bunu, yüksek proliferatif hücrelerin kriptleri doldurduğu ve yedinci güne kadar normalleşme aşamasına yol açan rejeneratif faz izledi. EYFP tarafından yapılan soy izlemesi, homeostaz sırasında, Bmi1 pozitif rezerv kök hücrelerinden kaynaklanan hücrelerin, kriptler içindeki artı dört ila artı altı pozisyonla sınırlı olduğunu göstermiştir. EdU ve Ki-67 boyaması, sahte ışınlanmış farelerde, aktif kök hücrelerden transit yükseltici bölgeye kadar uzanan normal bağırsak homeostazı gösterdi.Apoptotik faz sırasında, radyasyon hasarının neden olduğu proliferatif hücrelerin kaybı ile birlikte EYFP-pozitif hücrelerin sayısı azaldı. Rejeneratif fazda, rezerv kök hücrelerin aktivasyonu ve Bmi1-pozitif hücrelerin hızlı proliferasyonu gözlendi. Daha fazla proliferasyon ve migrasyon bağırsak epitel bütünlüğünü yeniden sağladı.TUNEL boyaması, homeostaz sırasında apoptotik hücrelerin bulunmadığını gösterdi. Apoptotik fazda geç dönemde TÜNEL boyamasında artış gözlendi. Rejeneratif faz sırasında, TUNEL boyaması, rejenere kriptler içinde istikrarlı bir şekilde azaldı ve kriptolar normalleştiğinde neredeyse hiç yoktu.Bu teknik, yaralanma sonrası bağırsak rejenerasyonu sırasında spesifik hücre soylarının rolü hakkında daha derinlemesine bilgi toplamak için RNA dizileme, tek hücreli RNA dizileme, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama veya proteomik analiz ile birleştirilebilir. Araştırmacılar, bağırsak epitelinin rejeneratif kapasitesinin anlaşılmasını genişletmek için bağırsak rejenerasyonunda mikrobiyota ve epitelyal, stromal ve bağışıklık hücresi popülasyonları arasındaki etkileşimleri araştırabilirler.

İyonlaştırıcı Işınlamaya Yanıt Olarak Bağırsak Epitelyal Rejenerasyonu

Abstract