이 연구는 절강 성의 자연 과학 재단 (보조금 없음)의 지원을 받았다. LY19H060001) 및 절강 전통 중국 의학 과학 기술 계획 프로젝트 (no. 2022ZB093).

본 연구의 모든 실험은 절강 중국 의과 대학 실험실 동물 연구 센터 (승인 번호 : IACUC-20181029-11)의 동물 실험 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 세포 추출
<ol><li>Sprague-Dawley 래트 (SD 래트, 1-10 일령, 남성 또는 여성)를CO2 로 채워진 안락사 케이지에 30 % -70 % 용기 부피 / 분의 균형 잡힌 속도로 넣으십시오. 쥐가 의식을 잃은 후 (20-60 분), 통증없는 죽음을 보장하...

<ol>
	<li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions.">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).</li><li>Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+mechanisms,+and+significance+of+macrophage+plasticity.">Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.</a> Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).</li><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Ono, T., Nakashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+osteoclast+biology.">Recent advances in osteoclast biology.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#223;-catenin-mediated+p53+suppression+is+indispensable+for+osteogenesis+of+mesenchymal+progenitor+cells.">Wnt/&#223;-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (6), 521-534 (2021).</li><li>Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-206+is+required+for+osteoarthritis+development+through+its+effect+on+apoptosis+and+autophagy+of+articular+chondrocytes+via+modulating+the+phosphoinositide+3-kinase/protein+kinase+B-mTOR+pathway+by+targeting+insulin-like+growth+factor-1.">microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).</li><li>Li, Z., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+investigating+how+bone+marrow+adipocytes+influence+bone+and+hematopoietic+cellularity.">Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity.</a> Best Practice &amp; Research. Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).</li><li>Horowitz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+adipocytes.">marrow adipocytes.</a> Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).</li><li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+frommice.">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56750 (2018).</li><li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung.">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).</li><li>Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+interstitial+macrophages+from+the+lungs+using+different+digestion+enzymes+and+staining+strategies.">Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).</li><li>Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sequential+culture+approach+to+study+osteoclast+differentiation+from+nonadherent+porcine+bone+marrow+cells.">A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).</li><li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+culture+and+resorption+assays.">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood,+bronchoalveolar+lavage,+and+lung+tissues.">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).</li><li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consistent+method+to+identify+and+isolate+mononuclear+phagocytes+from+human+lung+and+lymph+nodes.">A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).</li><li>Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+osteoclast+precursor+populations+in+murine+bone+marrow.">Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).</li><li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state.">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li><li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-speed+western+blot+using+immunoreaction+enhancing+technology.">Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61657 (2020).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759 (2008).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycyrrhizic+acid+suppresses+osteoclast+differentiation+and+postmenopausal+osteoporosis+by+modulating+the+NF-&#954;B,+ERK,+and+JNK+signaling+pathways.">Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-&#954;B, ERK, and JNK signaling pathways.</a> European Journal of Pharmocology. 859, 172550 (2019).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRc17+controls+BMSC+senescence+via+mitophagy+and+inhibits+the+therapeutic+effect+of+BMSCs+on+ovariectomy-induced+bone+loss.">LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss.</a> Redox Biology. , (2021).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioacetamide+promotes+osteoclast+transformation+of+bone+marrow+macrophages+by+influencing+PI3K/AKT+pathways.">Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways.</a> Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).</li></ol>

파골세포는 골 질환의 발생 및 발달에 관여하는 가장 중요한 세포 유형 중 하나이며, 골 질환 연구20의 주요 목적 중 하나입니다. 단핵구 / 대식세포는 파골세포로 분화 될 수 있습니다. 단핵 대식세포(RAW264.7 세포)는 구입하기에 너무 비싸고 배양 중에 쉽게 활성화되기 때문에, 이 세포주를 이용한 시험관내 분화 실험을 수행하는 것은 어렵다. 골수에서 단핵구/대식세포를 ?...

골수에 존재하는 단핵구-대식세포 혈통세포는 혈액 단핵구 및 조직 대식세포 1,2로 분화할 수 있다고 보고되었다. 뼈의 성장과 발달의 균형을 맞추기 위해 파골세포로 분화할 수 있는 상기 세포들은 일반적으로 생체내 파골세포를 유도하기 위한 세포 모델로서 사용된다3,4. 골수는 골수 중간엽 줄기 세포, 골수 단핵구 - 대식 세포 (BMMs), 조혈 줄기 세포, 내피 세포 및 면역 세포를 포함하지만 이에 국한되지 않는 여러 가지 유형의 세포를 포함하는 특수 조직입니다. 사실, 이전의 여러 연구에 따르면 긴 뼈의 골수강에서 밀려난 부착 세포는 조골 세포, 파골세포, 연 골 세포 또는 지방세포 5,6,7,8로 분화 될 수 있다고 제안했습니다. 상이한 동질적인 세포 집단을 생산하기 위해 상이한 분리 및 배양 방법이 사용되었지만, 다양한 상이한 세포 유형으로부터 BMM을 단리하고 배양하는데 여전히 큰 도전이 있다.
골수 단핵 대식세포 (BMSCs)를 추출하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다. 그러나 이러한 방법의 대부분은 복잡한 9,10,11입니다. 예를 들어, 밀도 구배 원심분리에는 특수 키트가 필요하며 작업은 시간이 많이 걸리고 번거롭다. 이 방법은 대량 혈액 샘플에서 BMM을 분리하는 데 적합하지만 골수 샘플 9,12,13에서는 그렇지 않습니다. 또한, 콜라게나제 소화를 사용하여 조직 샘플을 추출하는 것은 복잡하고 시간이 많이 걸리는 절차입니다. 이 방법은 골수 샘플14,15에서 BMM을 분리하는 데 권장되지 않습니다. 또한, 유동 분리는 고도로 정제된 단핵구/대식세포 집단을 초래할 수 있지만, 매우 큰 표본 크기와 높은 장비 및 장비 요구 사항10,16을 필요로 한다. 추가적으로, 마이크로비드 농축 방법은 매우 비싸고, 일반 실험실(17)에서 실현가능하지 않다.
따라서, 현재의 연구에서는 골수로부터 단핵 대식세포를 분리하기 위해 편리하고, 빠르고, 값싼 방법이 제안되었다. 상이한 시점 동안 부착된 골수 세포는 이차 부착 방법을 사용하여 BMMs를 분리하는데 사용되었다. 상기 방법으로 추출된 BMM은 시험관내에서 파골세포의 형성을 유도할 수 있었고, 따라서 시험 관내에서 골다공증에 대한 미래의 연구를 위한 간단하고 편리한 세포 모델을 제공한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm2 cell climbing slices</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>80102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cathepsin K</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19027</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11 isotype control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab172730</td>
			<td>1 &#956;g/test,1.675 mg/Ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11b/c</td>
			<td>Absin</td>
			<td>abs124232</td>
			<td>&#160;1&#956;g/test, 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRAP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab191406</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>&#160;AF5003</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell climbing slices</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>80102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td>corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>corning</td>
			<td>430168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>for IF, 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721</td>
			<td>for WB, 1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Pepro tech</td>
			<td>400-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>Pepro tech</td>
			<td>400-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD rat</td>
			<td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd</td>
			<td></td>
			<td>1-10 days old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel preparation kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRAP/ALP Staining Kit</td>
			<td>Wako</td>
			<td>294-67001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL512A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright-Giemsa solution</td>
			<td>Keygen Biotech</td>
			<td>KGA225-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of monocyte-macrophage lineage cells from rat bones by secondary adherence method

뼈 미네랄 밀도가 감소하면 뼈가 골절 될 가능성이 높아 환자의 삶의 질에 부정적인 영향을 미칩니다. 뼈의 성장과 발달은 주로 조골 세포와 파골 세포에 의해 조절됩니다. 파골세포는 골수 단핵구-대식세포(BMMs)로부터 유래된다는 것이 널리 받아들여지고 있다. BMM 및 기타 조혈 줄기 세포는 골수 공동에 위치한다. 따라서, 상이한 이종 및 이종 세포 집단으로부터 단일 안정한 BMM을 단리하는 것은 큰 도전이다. 여기서 우리는 보조 순응 방법이라고 불리는 SD 쥐로부터 BMM을 분리하기위한 프로토콜을 제시합니다. 일차 배양에서 24-48 h 동안 배양된 부착성 세포를 수집하였다. 유세포 분석 결과 세포의 약 37.94%가 CD11b/c+(단핵구-대식세포 표면 항원)인 것으로 나타났다. 타르트레이트 내성 산 포스파타제(TRAP) 염색 및 웨스턴 블롯 분석은 BMM이 시험관 내에서 파골세포로 분화될 수 있음을 입증하였다. 위의 발견은 이차 부착 세포가 파골세포 분화 연구에 적합한 세포 모델로 간주 될 수 있음을 시사했다.

이차 부착성 세포 집단은 안정하고 균일하였다. 지속적인 세포 증식으로 대부분의 세포는 불규칙한 모양으로 더 커졌고 방사형 부착 디스크로 성장했습니다 (그림 2C, D). 유세포 분석기는 단핵구-대식세포 계통 세포의 표면에 있는 분자 마커인 CD11b/c를 발현하는 세포의 비율이 약 37.94%인 것으로 나타났다(도 2A<strong...

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Isolation of Monocyte-Macrophage Lineage Cells from Rat Bones by Secondary Adherence Method

여기서 우리는 보조 순응 방법이라고 불리는 SD 쥐로부터 BMM을 분리하기위한 프로토콜을 제시합니다.

이차 부착 방법에 의한 쥐 뼈로부터 단핵구-대식세포 계통 세포의 분리

With a decrease of bone mineral density, bones are more likely to fracture, thus negatively affecting a patient's quality of life. The growth and ...

이 프로토콜에서, 골수 단핵구-대식세포는 이차 부착 방법에 의해 추출된다. 골수 단핵구-대식세포는 파골세포로 성공적으로 분화할 수 있으며, 이는 시험관 내에서 파골세포의 연구를 위한 안정한 세포 모델을 제공한다. 이 방법은 작은 골수 샘플에 적합하며 첨단 실험실 장비를 필요로하지 않고 골수에서 골수 단핵구 - 대식세포 세포를 간단하고 신속하게 추출 할 수 있습니다.파골세포의 증가는 골다공증의 잠재적 발병기전일 수 있다. 골수 단핵구-대식세포는 파골세포 전구체 세포로서 특정 연구 가치를 갖는다. 시작하려면 안락사 된 쥐를 소독을 위해 75 % 알코올에 10 분 동안 담그십시오.가위와 집게로 쥐의 모든 팔다리를 조심스럽게 제거한 후, 피펫을 사용하여 PBS로 흡인하고 팔다리에 부착 된 혈액을 플러시하십시오. 그런 다음 10 % FBS DMEM의 두 밀리리터에서 다섯 밀리리터 튜브에 넣습니다. 사지 뼈를 다섯 밀리리터 튜브로 옮긴 후 가위를 사용하여 튜브의 사지 뼈를 작은 조각으로 자르고 균질액을 혼합하여 골수 세포를 배양 배지에 재현탁시킵니다.조직 파편이 튜브의 바닥에 정착 할 때까지 다섯 분 동안 방치하십시오. 다음으로, 10 밀리리터의 10 % FBS DMEM을 100 밀리미터 배양 접시에 넣은 다음 상청액을 배양 접시로 옮깁니다. 약 24시간 동안 5% 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 배양한다.이 배양 시간 후에, 대부분의 중간엽 줄기 세포는 배양 접시 벽에 부착되어 천천히 성장할 것이며, 반면에 대부분의 골수 단핵구-대식세포는 여전히 배양 배지에 현탁될 것이다. 세포 현탁액을 100 밀리미터 배양 접시에 새로운 25 센티미터 평방 플라스크로 옮기고 추가로 24 시간 동안 5 % 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 세포를 계속 배양한다. 오래된 배지를 조심스럽게 제거한 후, 골수 단핵구-대식세포가 플라스크 벽에 부착된 후 신선한 배지로 교체한다.유세포 분석기는 단핵구-대식세포 계통 세포의 표면에 분자 마커인 CD11b 및 c를 발현하는 세포의 비율이 약 37.94%로 나타났다. TRAP 염색 결과는 대조군과 비교하여, 핵인자인 카파 B 리간드 및 대식세포 콜로니 자극인자의 수용체 활성화제로 유도된 세포에서 세포내 보라색 적색 과립의 수가 유의하게 증가하였다는 것을 보여주었다. 웨스턴 블롯 분석은 파골세포 특이적 단백질 TRAP 및 카텝신 K의 발현 수준이 대조군에 비해 처리된 세포에서 유의하게 증가하였다는 것을 입증하였다.이 절차에서 가장 중요한 것은 일차 배양 후 24 내지 48 시간에 이차 부착성 세포를 수집하는 시간이며, 골수 단핵구-대식세포 세포가 완전히 부착되기 시작한다. 골수 단핵구-대식세포는 시험관내에서 파골세포로 유도될 수 있으며, 골다공증 연구를 위한 안정한 세포 모델을 제공한다.

이차 부착 방법에 의한 쥐 뼈로부터 단핵구-대식세포 계통 세포의 분리

Abstract