이 연구를 지원하기 위해 미국 화학 학회 석유 연구 기금의 기부자에게 감사를 표합니다(보조금 번호 60191-UNI5). 저자는 부동액 단백질과 얼음을 연구하기 위해 미세 유체 장치의 사용을 개척 한 Ido Braslavsky 교수에게 감사드립니다. 저자는 부동액 단백질 샘플을 제공 한 Arthur DeVries 교수, Konrad Meister 교수 및 Peter Davies 교수에게 감사드립니다.

1. 미세 유체 장치 제작
<ol><li>페트리 접시의 내부 표면을 알루미늄 호일로 덮고 미리 준비된 금형을 페트리 접시에 넣습니다.<ol><li>참고문헌에 설명된 리소그래피 기술을 사용하여 금형을 제작합니다. 현재 작업에 사용 된 두 가지 장치 설계가 그림 1에 나와 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>경화제와 엘라스토머의 1:10(중량비) 혼합물( 재료 표 참조)의 무게를 달고 혼합물이 흰색이고 거의 불투명하게 나타날 때까지 약 5분 동안 계속 혼합하여 PDMS 혼합물 30-40mL를 준비합니다. 알림: 플라스틱 컵을 저울에 놓고 엘라스토머를 컵에 부은 다음 경화제를 추가하여 1:10 중량비를 달성하십시오.</li>
	<li>PDMS 혼합물을 몰드와 함께 페트리 접시에 붓고 기포가 남지 않을 때까지 데시케이터에서 가스를 제거합니다(약 30분).</li>
	<li>액체 PDMS로 몰드를 오븐이나 70°C의 핫 플레이트에서 고무와 같은 일관성이 얻어질 때까지 굽습니다. 이 과정은 약 한 시간이 걸립니다.</li>
	<li>메스로 피처 주위를 추적하여 장치를 잘라내고 곰팡이가 깨지기 쉽기 때문에 메스를 아래로 누르지 말고 앞으로 밀도록 주의하십시오. 잘라낸 PDMS 장치를 꺼내 새 페트리 접시에 거꾸로 놓습니다. 접착 테이프를 부착하고 제거하여 바닥면에서 먼지와 먼지 입자를 제거하십시오( 재료 표 참조).</li>
	<li>필요한 경우 현미경을 사용하여 무딘 주사기 바늘 (20G)을 사용하여 각인 된 패턴을 기반으로 장치의 구멍을 뚫습니다. 구멍이 장치의 다른 쪽을 관통하는지 확인하고 핀셋을 사용하여 펀치 아웃 조각을 제거하십시오.</li>
	<li>커버 슬립 (18 x 18 mm, 두께 0.14 mm)을 물과 비누로 철저히 씻은 다음 이소프로판올로 씻으십시오. 공기 압력을 사용하여 청소된 커버슬립을 건조시킵니다.</li>
	<li>청소한 PDMS와 커버슬립을 플라즈마 클리너에 삽입하고 밸브를 닫은 다음 전원, 진공 및 펌프를 켭니다. 플라즈마 클리너를 약 1분 동안 작동시키고 RF를 HI로 설정한 다음 미세 밸브를 사용하여 약간의 공기가 플라즈마 클리너로 들어가도록 합니다.<ol><li>보기 창의 색상이 보라색에서 분홍색으로 바뀌면 플라즈마 클리너가 50초 동안 작동하도록 하고 RF를 끕니다. 펌프를 잠시 켜두었다가 끈 후 메인 밸브를 서서히 열어 공기가 플라즈마 클리너로 들어갈 수 있도록 합니다. 참고: 비교 가능한 결과를 얻는 다른 방법은 열 결합입니다. 이 방법의 경우 금형을 커버 슬립에 놓고 70-80 ° C로 설정된 핫 플레이트에 약 60 분 동안 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>PDMS 표면을 청소된 커버슬립에 누르고 커버슬립을 약간 위로 당길 때 분리되지 않는 것을 관찰하여 접착되었는지 확인합니다.</li>
	<li>펜치로 90° 무딘 바늘(18G)의 바늘을 고정하고 플라스틱 주사기 커넥터를 당겨 제거합니다. 바늘의 한쪽 끝을 Tygon 튜브 (0.020 "ID, 0.060"OD, 재료 표 참조)에 삽입하고 다른 쪽 끝을 장치의 천공 구멍 중 하나에 삽입합니다. 다른 구멍에 대해서도 이 과정을 반복합니다.</li>
	<li>기포를 제거하려면 유리 주사기로 채널에 물/버퍼를 주입합니다(펌프는 선택 사항이지만 여기서는 펌프가 사용되지 않음). 장치에 주입하기 전에 0.22μm 필터로 모든 액체를 여과하십시오.</li>
	<li>형광 표지된 AFP가 PDMS 벽에 결합하는 것을 방지하기 위해 1% BSA 용액과 같은 차단제를 사용하십시오. 차단제를 입구 채널에 주입하고 20분 동안 마이크로채널에 남아 있도록 합니다. 그런 다음 버퍼 용액을 입구 채널에 주입하여 BSA 용액을 플러시합니다. 알림: 결과 PDMS 장치는 바닥 표면을 따라 커버슬립에 부착되고 입구 및 출구 구멍의 튜브에 연결되며 채널의 차단제로 코팅됩니다.</li>
</ol>2. 미세유체 장치 설정
<ol><li>구리 콜드 스테이지 표면에 소량의 침지 오일을 바르고( 재료 표 참조) 보풀이 없는 물티슈를 사용하여 펴 발라 얇은 오일 층을 만듭니다. 그런 다음 생성 된 오일 층에 깨끗한 사파이어 디스크 ( 재료 표 참조)를 놓습니다. 침지 오일 방울을 사파이어 디스크의 중앙에 바르고 PDMS 장치를 드롭에 배치하여 장치의 기능이 콜드 스테이지의 보기 구멍 위에 정렬되도록 합니다.</li>
	<li>장치를 제자리에 고정하고 접착 테이프를 사용하여 콜드 스테이지를 수용하는 알루미늄 상자의 외벽에 튜브를 고정합니다. 각 특정 튜브의 배치를 기록해 둡니다.</li>
	<li>유리 주사기를 사용하여 4-5μL의 AF(G)P 용액( 재료 표 참조)을 입구 채널에 주입합니다. 차가운 단계의 뚜껑을 닫으십시오. 참고: AFP 용액의 농도는 형광 강도에 따라 다양하고 결정될 수 있습니다. 본 프로토콜에서, 농도의 범위는 5-40 μL이었다.</li>
</ol>3. 미세유체 채널에서 단결정의 형성
<ol><li>내부에 응결이 형성되는 것을 방지하기 위해 건조한 공기/질소로 차가운 단계를 퍼지하십시오. 순환 냉각 수조를 활성화하여 차가운 단계를 통해 물을 순환시키고 방열판 역할을 합니다.</li>
	<li>온도 제어 프로그램을 시작하고 온도를 -25 °C로 설정하십시오. 알림: 샘플이 ~-20°C의 온도에 도달하면 동결이 발생하며 이는 샘플이 갑자기 어두워지고 거칠어지는 것으로 관찰될 수 있습니다. 임의의 대물렌즈가 이 시점에서 사용될 수 있으며, 바람직하게는 4x 대물렌즈가 사용될 수 있으며, 이는 사용자가 마이크로유체 채널의 전체를 관찰할 수 있게 한다.</li>
	<li>천천히 온도를 약 1 ° C / 5 초 씩 높이면 AF (G) P 용액에 사용 된 버퍼에 따라 -1에서 -0.2 ° C 범위 인 샘플의 융점에 접근합니다. 온도가 녹는점에 가까워지면 몇 개의 단결정이 분리될 때까지 기다리십시오. 참고: 필요한 경우 현미경에 고정된 IR 레이저(980nm)( 재료 표 참조)를 사용하여 원하지 않는 얼음을 국부적으로 녹일 수 있습니다. 레이저는 켜져 있는 한 근처의 얼음 결정을 녹입니다.</li>
	<li>이 시점에서 단결정을 더 잘 관찰하기 위해 10x 또는 20x 대물렌즈로 전환하는 것이 좋습니다. 원하는 위치에서 단결정을 얻은 후 결정의 가장자리가 채널 벽과 만날 때까지 온도를 약간 낮추어 (~ 0.01 ° C) 결정을 성장시킵니다.</li>
	<li>50x 대물렌즈로 전환하고 AF(G)P 용액을 채널에 주입하고 형광 강도 증가를 관찰하여 단백질 용액이 채널에 성공적으로 주입되었음을 나타냅니다. 용액을 교환하는 동안 얼음 결정이 녹지 않도록 이 단계를 신중하게 수행하십시오. 유속(유리 주사기에 더 많거나 적은 압력을 가하여)과 용액 교환 과정 중 온도를 면밀히 모니터링하고 조정합니다.</li>
	<li>단백질이 축적되어 결정 표면에 결합할 수 있는 충분한 시간을 허용하십시오. 알림: 이는 AF(G)P 5,25의 축적 및 흡착률에 따라 다릅니다. 일반적인 실험에서 AFP 축적에 5-10 분이 허용됩니다.</li>
</ol>4. 열 히스테리시스(TH) 활동 측정
참고: 이 단계는 선택 사항입니다.
<ol><li>0.002 °C의 작은 단계로 온도를 조정하고 작은 결정이 녹지 않고 적용될 수있는 최고 온도를 관찰하여 결정의 융점을 결정하십시오.</li>
	<li>온도 컨트롤러의 RAMP 기능에서 냉각 속도를 -0.05에서 -0.01°C/4초로 설정하고 램프를 활성화합니다. 갑작스런 결정 성장이 발생하는 정확한 온도에 유의하십시오. 알림: 이 값을 버스트 온도라고 하며 동결 온도에 해당합니다. 용융 온도와 동결 온도의 차이는 TH 활성(25)이다.</li>
</ol>5. 단결정 주위의 용액 교환
<ol><li>실험 중 결정의 용융 또는 성장을 방지하기 위해 샘플 온도가 TH 간격에 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>나중에 형광 데이터 분석을 위해 NIS Elements 이미징 프로그램( 재료 표 참조)을 사용하여 용액 교환 프로세스를 기록합니다. 완충 용액을 미세유체 장치의 제2 입구에 천천히 주입하고, 주사기에 가해지는 압력에 의존하는 속도로 형광 신호의 감소를 관찰한다.<ol><li>이 시각적 표현을 사용하여 적용된 압력이 너무 높지 않아 결정이 녹지 않도록하십시오. 그림 2 에서 솔루션 교환 프로세스를 보여 주는 이미지 시퀀스를 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>이미징 프로그램을 사용하여 미세유체 채널에서 형광 강도를 측정합니다. 알림: 신호는 AFP 결합을 나타내는 결정 표면 근처의 영역에서 최고조에 달해야 하며 버퍼로 플러시된 주변 용액에서 상대적으로 낮아야 합니다.</li>
	<li>단계 4에 이어 용액 교환 후의 TH 활성을 측정한다.</li>
	<li>새로운 결정을 분리하여 실험을 반복하십시오 (3.3-3.5 단계). 유리 주사기로 AFP 용액을 주입하고 용액 교환을 반복하십시오 (5.1-5.3 단계). 새로운 단결정 (단계 3.3-3.5)을 얻고 유리 주사기를 사용하여 AFP 용액을 채널 내로 흘려줍니다.</li>
</ol>6. 포접 수화물 실험
<ol><li>THF 수화물을 얻으려면 1:15의 몰비(부피비 1:3.326)의 THF/물 용액을 준비합니다. AF(G)Ps 또는 기타 억제제를 포함하는 용액을 포함하여 다음 실험에 사용된 모든 용액에서 이 비율을 유지하십시오.</li>
	<li>1단계와 2단계에 따라 미세유체 장치를 준비하고 차가운 단계에 두십시오. 온도를 -25 °C로 설정하십시오. 샘플은 단계 3.2에 설명된 대로 ~-20°C에서 동결됩니다.</li>
	<li>THF 용액이 얼린 후 모든 얼음이 녹을 때까지 천천히 온도를 높입니다. 알림: 얼음의 녹는 점은 THF에 의해 약간 낮아집니다.</li>
	<li>수화물을 제외한 모든 얼음 결정이 녹도록하려면 온도를 1 ° C에서 3 분 동안 유지하십시오.</li>
	<li>온도를 -2°C로 설정하고 억제제가 없는 상태에서 미세유체 채널에 나타나는 수화물의 풍부함을 관찰합니다. 참고: THF 수화물은 팔면체 모양이며(그림 2), 경우에 따라 결정이 매우 얇습니다. 따라서 명확한 관찰이 어려울 수 있습니다. 이 경우 6.4-6.5 단계를 반복하여 새 결정을 얻는 것이 좋습니다.</li>
	<li>유리 주사기를 사용하여 AF (G) P / 억제제를 미세 유체 채널에 주입하면서 온도를 조정하여 얻은 결정이 녹거나 성장하지 않도록합니다. 억제제 분자가 결정 표면에 흡착 될 때까지 몇 분 정도 기다리십시오.</li>
	<li>필요한 경우 4단계에 따라 TH 활동을 측정합니다.</li>
	<li>단계 5.2-5.3에 설명된 대로 결정 주위의 용액을 교환합니다.</li>
</ol>

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+unsteady+morphologies+at+ice+interfaces+driven+by+D2O-H2O+exchange.">Dynamics and unsteady morphologies at ice interfaces driven by D2O-H2O exchange.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11627-11632 (2017).</li><li>Deng, J., Apfelbaum, E., Drori, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+growth+acceleration+by+antifreeze+proteins+leads+to+higher+thermal+hysteresis+activity.">Ice growth acceleration by antifreeze proteins leads to higher thermal hysteresis activity.</a> Journal of Physical Chemistry B. 124 (49), 11081-11088 (2020).</li></ol>

본 프로토콜은 결정 성장 및 억제에 대한 새로운 통찰력을 밝히기 위해 미세 유체 흐름과 미세 결정의 조합을 활용하도록 설계되었습니다. 밀리켈빈 분해능 온도 제어 콜드 스테이지(27)는 미세유체 채널 내부에 위치한 단일 미세결정의 제어를 가능하게 하여 주변의 용액을 교환할 수 있습니다. 미세유체 장치의 제조는 표준적이고 일반적인 관행(17,18)과 유사하지만, 장치 내부의 결정의 성장 및 용융에 대한 제어는 독특하고 참신하다. 이 시스템에서 가장 중요한 구성 요소는 Peltier 열전 냉각기, 시료 가까이에 위치한 서미스터의 피드백 및 피드백 루프를 제어하는 고분해능 온도 컨트롤러를 사용하여 달성되는 탁월한 온도 제어입니다.
또 다른 중요한 단계는 이 과정에서 결정이 녹거나 성장할 수 있기 때문에 용액 교환 자체입니다. 따라서 성장/용융을 방지하기 위해 용액 교환 중에 온도를 조정해야 합니다. 미세 유체 채널에서 결정의 형성은 액체 흐름을 방해하고이 시스템의 주요 과제를 제기합니다. 따라서 이러한 결정의 성장을 제어해야합니다. 여기서, IR 레이저(980nm)를 도립 현미경 상에 장착하고, 원치 않는 얼음/수화물 결정(28)을 국부적으로 녹이기 위해 사용하였다. 이러한 레이저를 사용할 수 없는 경우 미세 유체 장치의 금속 커넥터는 추가 펠티에 열전 냉각기로 가열할 수 있으며, 이는 장치의 입구/출구에 있는 얼음을 녹일 것입니다.
여기에 설명된 방법에는 자체 개발한 기기(콜드 스테이지)가 포함되며 위에서 언급한 단계 중 일부가 까다롭기 때문에 교육이 필요합니다. 결정을 둘러싸는 용액의 농도는 흐름이 의도되지 않은 경우에도 변할 수 있으므로 간단한 보정 단계5 는 형광 신호를 기반으로 농도의 신뢰할 수 있는 추정을 제공할 수 있습니다. 원치 않는 흐름에 대한 또 다른 가능한 해결책(예를 들어, TH 측정 중)은 참고문헌4에 기술되어 있는 미세유체 밸브이다.
이 시스템은 또한 H2O 액체에서D2O얼음의 성장 거동을 탐구하는데 사용되었는데, 이 연구는 미세한 가리비 얼음 표면(27)의 새로운 현상을 밝혀냈다. 따라서, 미세 유체 공학은 온도 변화에 잘 반응하는 다양한 결정질 시스템의 연구에 사용될 수있다.

부동액 단백질(AFP) 및 부동액 당단백질(AFGP)은 다양한 저온 적응 유기체를서리 손상으로부터 보호합니다1. AFP 및 AFGP (AF (G) Ps로 일반화)는 표면에 비가역적으로 결합하고 Gibbs-Thomson 효과 2,3,4,5로 인해 추가 성장을 억제함으로써 얼음 결정의 성장을 억제합니다. 크게 변하지 않는 용융 온도와 새로 저하 된 동결 온도 사이에 형성되는 결과 갭을 열 히스테리시스 (TH)라고하며 AFP 활성6에 해당하는 측정 가능한 매개 변수를 나타냅니다. 얼음 성장을 억제하기 위해 AFP를 사용하는 것은 광범위하고 다양한 응용 분야를 가지고 있으며 냉동 보존, 냉동 식품 품질 및 추위에 노출 된 작물 보호를 포함한 다양한 분야에서 잠재적 인 향상을 제공합니다.
작은 유기 분자의 존재하에 저온 및 고압에서 물의 결정화는 포접 수화물 (또는 가스 수화물)의 형성을 초래하며, 여기서 가장 풍부한 수화물은 메탄 수화물7이다. 가스 / 오일 흐름선에서 메탄 하이드레이트의 결정화는 가스 점화 8,9,10으로 인한 폭발을 일으킬 수있는 플러그를 유발할 수 있습니다. 유동선에서 수화물 결정화를 방지하기위한 현재의 노력에는 열역학 (알코올 및 글리콜) 및 운동 (주로 폴리머) 억제제11,12,13,14를 사용하는 것이 포함됩니다. AFP는 또한 포접 수화물 결정에 결합하고 이들의 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 플러그의 형성을 방해하기 위해 AFP의 잠재적 사용을 지적함으로써 더 친환경적인 용액(15)을 제공한다.
Microfluidics는 마이크로 채널16의 네트워크를 통해 흐르는 극소량의 샘플 부피 (fL까지)에서 유체의 특성을 연구하는 데 사용되는 널리 사용되는 방법입니다. 마이크로채널은 리소그래피(17)를 사용하여 실리콘 웨이퍼(몰드) 상에 생성된 패턴을 따른다. 미세 유체 장치를 제조하는 데 일반적으로 사용되는 재료는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)으로, 연구 실험실에서 저렴하고 비교적 간단하게 작업 할 수 있습니다. 기능 (채널)의 디자인은 장치의 특정 목적과 관련하여 구성됩니다. 따라서, DNA 감지(18), 의료 진단(19) 및 결정화 공정(3,20,21)을 포함하는 다양한 응용에 활용될 수 있다.
본 프로토콜은 AFP 및 AFGP를 포함하는 다양한 억제제로 미크론 크기의 얼음 및 수화물 결정을 성장시키는 독특한 미세 유체 방법을 설명합니다. 이들 실험을 위해, 테트라히드로푸란(THF) 하이드레이트는 압력 및 온도 제어(23)를 위한 특수 장비를 필요로 하는 메탄 가스 하이드레이트(22)의 특성을 모방하기 위해 사용되었다. 형광 표지 AF(G)P는 결정 표면에 대한 단백질의 흡착을 시각화하고 분석하는 데 사용되었으며, 형광 이미징과 결합된 미세유체 접근 방식을 통해 결정 표면에 대한 이러한 분자의 결합 과정의 주요 특징을 얻을 수 있었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-micron filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-degree bent blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins</td>
			<td>A gift</td>
			<td></td>
			<td>See references 5 and 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18 Gauge and 20 Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold stage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td></td>
			<td>18 X 18 mm, 0.14 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared laser 980 nm</td>
			<td>Opto Engine LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope, Eclipse Ti - S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invisible tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint-free wipe</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newport 3040 temperature controller</td>
			<td>Newport 3040</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil vacuum pump</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit)</td>
			<td>Dow Corning Syglard</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>16005-1010</td>
			<td>&#160;25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS Camera, Neo 5.5</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Microbore tubing for microfluidic device</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>&#160;0.020&#34; ID, 0.060&#34;OD, 100 ft/roll.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/8&#8221; ID, 3/16&#8221; OD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic approach for the study of ice and clathrate hydrate crystallization

물 결정화에 대한 정확한 기계론적 설명은 어렵고 몇 가지 핵심 요소가 필요합니다: 단일 현미경 결정의 형성을 허용하는 탁월한 온도 제어와 저온 단계에 결합된 적절한 현미경 시스템. 본원에 기술된 방법은 얼음 주위의 용액 교환을 포함하고 수화물 결정을 포접하는 것을 포함하는 또 다른 중요한 특징을 추가한다. 설명 된 시스템은 미세 유체 공학, 고해상도 콜드 스테이지 및 형광 현미경을 포함한 고유 한 자체 개발 기기의 조합으로 구성됩니다. 콜드 스테이지는 미세 유체 장치 용으로 설계되었으며 미세 유체 채널 내부에 미크론 크기의 얼음 / 수화물 결정을 형성하고 그 주위에 용액을 교환 할 수 있습니다. 저온 단계의 온도 분해능과 안정성은 1밀리켈빈이며, 이는 이러한 작은 결정의 성장을 제어하는 데 중요합니다. 이 다양한 시스템은 얼음과 수화물 결정화의 다양한 과정과 이러한 결정의 성장을 억제하는 메커니즘을 연구하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 미세 유체 장치를 준비하는 방법, 미세 유체 채널에서 미세 결정을 성장 및 제어하는 방법, 얼음 / 수화물 결정 주변의 액체 흐름을 활용하여 물의 결정화에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 방법을 설명합니다.

얼음 결정과의 용액 교환 얼음 결정 주위의 성공적인 용액 교환은 그림 3에 나와 있습니다. 각 스냅숏의 타임스탬프는 솔루션 교환이 비교적 빠르다는 것을 나타냅니다. 그러나 더 느린 교환이 가능합니다. 얼음이 흡착된 AFGP 분자에서 나오는 형광 강도는 교환이 완료된 후 명확하게 관찰됩니다(그림 3, 오른쪽). 얼음 표면의 AFP 농도에 대한 정량 분석은 지정된 관심 영역 (ROI) 도구를 사용하여 모니터링됩니다 (그림 4). 본 실험4에서, 50 mM Tris-HCl (pH 7.8) 및 100 mM NaCl로 희석된 AFP 타입 III (QAE 이소형)을 사용하였다. 용액은 쌍뿔 모양의 결정 주위에서 교환되고 용액과 얼음 위의 형광 강도가 모니터링됩니다. 용액의 형광 신호를 나타내는 빨간색 플롯은 용액 교환 중에 100배 감소하는 반면 얼음 표면의 계산된 신호(녹색 플롯)는 일정하게 유지됩니다. 얼음 흡착 분자의 계산 된 신호는 얼음4에서 오는 신호로부터 용액으로부터 오는 신호 (미세 유체 채널의 두께와 관련된 상수를 곱함)를 빼서 얻었다.
THF 수화물과의 용액 교환 THF 수화물을 사용한 미세유체 실험은 얼음을 사용한 실험과 유사하게 수행되었습니다. 수화물 결정이 용액으로부터 억제제 분자를 흡착하도록 허용된 후, 억제제-없는 용액을 채널에 주입하였다. 그림 5는 두 가지 유형의 억제제와의 용액 교환 후 THF 수화물을 제시합니다 : 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)로 표지된 AFGP1-5 (그림 5A) 및 형광 염료26 (그림 5B)인 사프라닌 O (재료 표 참조). 이것은 포접 수화물의 표면에 결합하는 AFGP의 첫 번째 시연입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig01.jpg"> 그림 1: 본 연구에서 사용된 마이크로유체 채널의 개략적인 표현. 두 디자인 모두 2개의 입구와 1개의 출구를 포함합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig02.jpg"> 그림 2: 온도가 ~-2°C로 냉각된 후 마이크로유체 채널에 형성된 THF 수화물. 제시된 모든 결정의 형태는 사면체입니다. 그러나 일부 결정은 방향이 다릅니다. 스케일 바 = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig03.jpg"> 그림 3: 미세유체 채널에서 단일 얼음 결정 주위의 용액 교환을 나타내는 대표적인 실험. 처음에, 용액은 FITC로 표지된 AFGP1-5 를 함유하였고, 얼음-흡착된 AFGP는 관찰되지 않았다. 용액을 AFGP-free 용액으로 교환 한 후, 이전에 얼음 표면에 흡착 된 단백질이 명확하게 검출되었습니다 (오른쪽 이미지). 스케일 바 = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig04v2.jpg"> 그림 4 : 얼음 표면의 AFP 농도에 대한 정량적 및 정성 분석. (A) 높은 AFP 용액 농도의 얼음 결정 (용액 교환 전). (b) AFP 용액을 AFP가 없는 완충용액으로 교환한 후의 동일한 결정. 스케일 바 = 20 μm. (C) 용액 교환 중 얼음 표면(검은색)과 용액(빨간색)의 형광 강도에 대한 정량 분석. 녹색 곡선은 얼음 표면에서 계산된 강도를 나타냅니다. 이 그림은 참고자료4의 허가를 받아 각색되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig04largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig05.jpg"> 그림 5: 미세 유체 채널에서 용액 주위 (A, AFGP1-5) 또는 (B,  Safranine O)를 교환 한 후 단일 THF 수화물 결정. (B)의 이미지는 참고자료26에서 재현한 것입니다. 스케일 바 = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization

본 프로토콜은 미세유체 장치에서 미세한 얼음 결정 및 포접 수화물의 결정화를 설명하여, 형성된 결정 주위에서 액체 교환을 가능하게 한다. 이것은 억제제의 결정화 과정과 결합 메커니즘을 검사할 수 있는 비할 데 없는 가능성을 제공합니다.

얼음 및 포접 수화물 결정화 연구를 위한 미세유체 접근법

An accurate mechanistic description of water crystallization is challenging and requires a few key elements: superb temperature control to allow the ...

이 프로토콜은 사용자가 용해성 분자와 결정 표면 사이의 상호 작용을 연구하고 검사하고 측정 할 수있게 해주는 독특한 원인입니다. 부동액 단백질이 얼음에 비가역적으로 결합하거나 이 방법을 사용하여 얻은 강력한 증거. 이 기술의 주요 장점은 미크론 크기의 얼음의 성장을 제어하고 결정을 수화하고 제어 된 방식으로 주변의 용액을 교환 할 수 있다는 것입니다.시작하려면 미리 준비된 금형을 알루미늄 호일로 덮인 유리 페트리 접시에 넣으십시오. 그런 다음 경화제와 엘라스토머의 혼합물을 1 내지 10 계량하고 혼합물이 흰색이고 거의 불투명하게 나타날 때까지 약 5분 동안 연속적으로 혼합하여 30 내지 40 밀리리터의 PDMS 혼합물을 준비합니다. 다음으로, PDMS 혼합물을 몰드와 함께 페트리 접시에 붓고 기포가 남지 않을 때까지 데시케이터에서 가스를 제거합니다.고무 같은 농도가 얻어질 때까지 오븐이나 섭씨 70도의 핫 플레이트에서 액체 PDMS로 금형을 굽습니다. 그런 다음 곰팡이가 깨지기 쉽기 때문에 메스로 피쳐 주위를 추적하여 장치를 잘라냅니다. 컷아웃 PDMS 장치를 제거한 후 새 페트리 접시에 거꾸로 놓습니다.무딘 주사기, 20 게이지 바늘을 사용하여 각인 된 패턴을 기반으로 장치의 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 세척된 PDMS와 커버슬립을 플라즈마 클리너에 삽입합니다. 밸브를 닫고 전원, 진공 및 펌프를 켭니다.플라즈마 클리너를 약 1분 동안 작동시키십시오. RF를 높게 설정하고 미세 밸브를 사용하여 일부 공기가 플라즈마 클리너로 들어가도록 합니다. 보기 창 색상이 보라색에서 분홍색으로 바뀌면 플라즈마 클리너가 50초 동안 작동하여 RF를 끕니다.펌프를 잠시 켜두었다가 끈 후 메인 밸브를 서서히 열어 공기가 플라즈마 클리너로 들어갈 수 있도록 합니다. 그런 다음 PDMS 표면을 청소된 커버슬립에 누르고 커버슬립을 약간 위로 당길 때 분리되지 않는 것을 관찰하여 접착되었는지 확인합니다. 한 쌍의 펜치로 90도 무딘 바늘의 바늘을 고정한 후 바늘의 한쪽 끝을 타이곤 튜브에 삽입하고 다른 쪽 끝을 장치의 천공 구멍 중 하나에 삽입하면서 다른 구멍에 대해 이 과정을 반복합니다.구리 콜드 스테이지의 표면에 소량의 침지 오일을 바르고 보풀이 없는 물티슈를 사용하여 펴 발라 얇은 오일 층을 만듭니다. 그런 다음 생성 된 오일 층에 깨끗한 사파이어 디스크를 놓습니다. 그런 다음 침지 오일 한 방울을 사파이어 디스크 중앙에 바르고 PDMS 장치를 물방울에 놓아 장치의 기능이 콜드 스테이지의 보기 구멍에 정렬되도록 합니다.장치를 제자리에 고정한 후 접착 테이프가 있는 알루미늄 상자의 외벽에 튜브를 고정합니다. 유리 주사기를 사용하여 4-5 마이크로 리터의 부동액 단백질 용액을 입구 채널에 주입하고 콜드 스테이지의 뚜껑을 닫습니다. 온도 제어 프로그램을 시작하고 온도를 섭씨 영하 25도로 설정합니다.그런 다음 5 초마다 약 섭씨 1도 씩 천천히 온도를 올립니다. 부동액 단백질 용액에 사용되는 완충액에 따라 섭씨 영하 1도에서 영하 0.2도 사이의 샘플 융점에 접근하십시오. 단결정을 더 잘 관찰하려면 10x 또는 20x 대물렌즈로 전환하십시오.그리고 원하는 위치에서 단결정을 얻은 후 결정의 끝이 채널 벽과 만날 때까지 온도를 약간 낮추어 결정을 성장시킵니다. 50x 대물렌즈로 전환한 후 부동액 단백질 용액을 채널에 주입하고 형광 강도 증가를 관찰하여 단백질 용액이 채널에 성공적으로 주입되었음을 나타냅니다. 용액 교환 과정을 기록하려면 NIS-Elements 이미징 프로그램을 사용하여 적용된 압력이 너무 높지 않은지 확인하고 완충 용액을 미세 유체 장치의 두 번째 입구에 천천히 주입하십시오.주사기에 가해지는 압력에 의존하는 속도로 형광 신호의 감소를 관찰하십시오. THF 수화물을 얻으려면 1 내지 15의 몰비로 THF 수용액을 제조한 후, 용액을 마이크로유체 장치에 주입한다. THF 수용액이 얼린 후 수화물을 제외하고 모든 얼음이 녹을 때까지 천천히 온도를 높이고 온도를 섭씨 1도에서 3분 동안 유지합니다.온도를 섭씨 영하 2도로 설정하고 억제제가 없을 때 미세 유체 채널에 나타나는 수화물의 풍부함을 관찰하십시오. 그런 다음 유리 주사기를 사용하여 부동액 단백질 또는 억제제를 미세 유체 채널에 주입하면서 온도를 조정하여 얻은 결정이 녹거나 성장하지 않도록하고 억제제 분자가 결정 표면에 흡착 될 때까지 몇 분 동안 허용합니다. 억제제가 없는 용액을 채널에 주입하여 용액 교환을 수행한다.용액 교환 전후의 결정 이미지를 촬영하고 이미징 프로그램을 사용하여 결정과 용액의 형광 강도를 분석합니다. 얼음 결정 주위의 성공적인 용액 교환이 수행되어 용액 교환이 비교적 빠르다는 것을 나타냅니다. 그러나 더 느린 교환이 가능합니다.얼음이 흡착된 부동액 당단백질 분자로부터 나오는 형광 강도는 교환이 완료된 후에 명확하게 관찰되었다. 부동액 단백질 농도의 정량 분석을 모니터링하고 용액 및 얼음 위에서 형광 강도를 측정하여 용액 교환 중에 용액의 형광 신호가 100배 감소하는 반면 얼음 표면에서 계산된 신호는 일정하게 유지됨을 나타냅니다. THF 수화물을 사용한 미세 유체 실험은 수화물 결정이 억제제 분자를 흡착하도록 허용 된 후 억제제가없는 용액을 채널에 주입하는 곳에서 수행되었습니다.THF 수화물은 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 형광 염료인 사프라닌 O로 표지된 부동액 당단백질을 포함한 두 가지 유형의 억제제와의 용액 교환 후 관찰되었습니다. 이 절차의 중요한 단계는 미세 유체 채널에서 단결정의 형성 및 분리와 그 주변의 용액 교환입니다. 이 방법은 억제제가 이러한 결정과 상호 작용하는 메커니즘을 이해하기 위해 온도에 매우 민감한 다른 결정 물질과 함께 사용할 수 있습니다.결정 주위에서 용액을 교환하는 능력은 연구원들이 부동액 단백질의 결합 메커니즘에 대한 주요 통찰력을 식별하고 얼음 성장에 대한 동위원소 효과의 새로운 현상을 발견할 수 있는 길을 열었습니다.

얼음 및 포접 수화물 결정화 연구를 위한 미세유체 접근법

Abstract