أنا ممتن لمارك ريديلا (إصلاح التقنيات الحيوية) وبراين هارر (جامعة ولاية نيويورك أبستيت) لتعليقاتهم المفيدة على هذا البروتوكول. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (GM133485).

لا يوجد تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

كان استخدام المجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) للبروتينات النقية المرئية نهجا مثمرا ومقنعا لتشريح الآليات الفريدة لتنظيم الهيكل الخلوي5،23،24،25،26،27،35. بالمقارنة مع المقايسات الكيميائية الحيوية التقليدية ، تتطلب تفاعلات TIRF كميات صغيرة جدا (50-100 ميكرولتر) ، ويمكن الحصول على قياسات كمية لديناميكيات الهيكل الخلوي من فحص فردي. تركز معظم دراسات ديناميكيات الهيكل الخلوي على نظام بوليمر واحد (أي خيوط الأكتين أو الأنابيب الدقيقة) ، وبالتالي ظلت القياسات التفصيلية للحديث المتبادل أو السلوكيات الناشئة بين خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة التي تظهر عادة في الخلايا بعيدة المنال ويصعب تلخيصها في أنبوب الاختبار. لحل هذه المشكلة ، يصف هذا البروتوكول نظام الفحص المجهري TIRF أحادي الخيط الذي يتيح التصور المباشر للأكتين الديناميكي وبوليمرات الأنابيب الدقيقة في نفس التفاعل الكيميائي الحيوي. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة تتجاوز الفحوصات التقليدية التي تلخص السلوك الديناميكي لخيوط الأكتين أو الأنابيب الدقيقة وحدها. تم تنفيذ هذه التقنية أيضا مع تاو كمثال على كيفية تغير العديد من الخصائص الديناميكية في وجود عامل اقتران الهيكل الخلوي. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع بروتينات إضافية معروفة أو يشتبه في أنها تنسق ديناميكيات الأكتين أو الأنابيب الدقيقة ، بما في ذلك (على سبيل المثال لا الحصر) MACF و GAS و formins والمزيد. وأخيرا، يمكن استخدام التحليلات المقدمة كدليل لتحديد كمية البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول.
"الرؤية هي الإيمان" هو سبب مقنع لإجراء الفحوصات القائمة على الفحص المجهري. ومع ذلك ، يلزم توخي الحذر في تنفيذ وتفسير تجارب الفحص المجهري TIRF. أحد التحديات الرئيسية لاختبارات التجميع المشترك للهيكل الخلوي هو أن العديد من ظروف التصوير الشائعة الاستخدام غير متوافقة مع كل بوليمر. عادة ما يكون للأنابيب الدقيقة والأكتين متطلبات مختلفة للعازل ودرجة الحرارة والملح والنيوكليوتيد والتركيز للبلمرة. الأكتين ، التوبولين ، البروتينات التنظيمية ذات الأهمية ، والمخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول حساسة لدورات التجميد والذوبان. لذلك ، من الضروري التعامل الدقيق مع البروتينات والمخازن المؤقتة لتنفيذ هذا البروتوكول بنجاح. للتخفيف من العديد من هذه المخاوف ، يوصى بشدة باستخدام توبولين معاد تدويره حديثا (مجمد لمدة <6 أسابيع) ، وإزالة الأكتينات المجمدة / المعاد تعليقها مسبقا عن طريق الطرد المركزي الفائق. تنطبق هذه الاعتبارات أيضا على عدد لا يحصى من البروتينات التنظيمية التي سيتم تقييمها باستخدام هذا الإجراء ، والتي قد تكون حساسة لدورات التجميد والذوبان أو تركيز الأملاح العازلة 5,11,36.
لسوء الحظ ، لا يوجد مخزن مؤقت واحد يناسب الجميع دون مقايضات تجريبية. لتخصيص المزيد من الحجم للبروتينات ذات التركيز المنخفض ، يمكن تضمين ATP و GTP في محلول المخزن المؤقت 2x TIRF (الشكل 1C). ومع ذلك ، نظرا لأن هذه النيوكليوتيدات حساسة للغاية لدورات التجميد والذوبان ، فلا ينصح بذلك. مركبات كسح الأكسجين المستخدمة هنا (أي الكاتالاز والجلوكوز أوكسيديز) ضرورية لتصور البروتينات لفترات طويلة من الزمن (دقائق إلى ساعات) ، ولكن من المعروف أنها تقيد بلمرة الأنابيب الدقيقة بتركيزات عالية5. فيما يتعلق بهذه الاعتبارات العازلة ، فإن أحد قيود هذا البروتوكول هو أن بعض البروتينات التنظيمية الأساسية المرتبطة بالأنابيب الدقيقة قد تتطلب ملحا أكثر أو أقل لتلخيص الوظائف الموجودة في الخلايا أو المقايسات باستخدام الأنابيب الدقيقة وحدها (بدون الأكتين). ومن المرجح أن يؤثر تغيير طبيعة الملح أو تركيزه لمعالجة هذه الشواغل على معدلات بلمرة خيوط الأكتين و/أو بارامترات ديناميات الأنابيب الدقيقة. مطلوب قياسات المعلمات الوصفية المتعددة (الحد الأدنى ، النوى ، معدلات الاستطالة ، والاستقرار) (الشكل 3) لتأكيد نجاح البروتوكول أو لتوثيق آثار المخازن المؤقتة المحددة أو البروتينات التنظيمية صراحة. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي الكثير من بلمرة خيوط الأكتين إلى حجب أحداث اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة في غضون ثوان. وبالتالي ، فإن ضبط الظروف التجريبية عن طريق خفض التركيز الكلي للأكتين أو تضمين بروتينات إضافية لقمع نواة الأكتين (أي البروفيلين) سيمدد الفترة الإجمالية التي يمكن فيها رؤية أنشطة الأكتين - الأنابيب الدقيقة المنسقة بوضوح. تعد عناصر التحكم التي تتناول هذه المتطلبات الأساسية ، والتكرارات التقنية (خارج مجالات الرؤية المتعددة) ، أمرا بالغ الأهمية للمستخدمين لإنشاء نتائج موثوقة وقابلة للتكرار.
توفر الدراسات القائمة على الخلايا فرصة محدودة لمراقبة العلاقات المباشرة بين البروتين والبروتين أو عمل المجمعات التنظيمية. في المقابل ، فإن بعض الآليات المستقاة من الفحوصات المخبرية لا تعكس دائما السلوكيات الدقيقة للبروتينات التي شوهدت في الخلايا. يمكن معالجة هذه المعضلة الكلاسيكية في الكيمياء الحيوية في التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية مع تعديلات محددة. على سبيل المثال ، تؤدي إضافة بروتينات اقتران وظيفية تحمل علامات الفلورسنت إلى توسيع هذه الطريقة من دراسات الخيوط المفردة إلى دراسات الجزيء الواحد. يمكن تعديل المقايسات بشكل أكبر لاستخدام مستخلصات الخلايا التي قد تضيف العوامل الرئيسية غير المعروفة "المفقودة" المطلوبة لتلخيص الظواهر الشبيهة بالخلايا. على سبيل المثال ، أعادت الفحوصات المستندة إلى TIRF باستخدام مستخلصات الخميرة أو Xenopus تشكيل حلقات الأكتوميوزين الانقباضية37 ، والمغزل الانقسامي 26,38 ، ومكونات تجميع الأكتين أو الأنابيب الدقيقة 39,40 ، وحتى الديناميكيات في السنتروسوم و kinetochores 36,41,42,43 . علاوة على ذلك ، قد تمهد هذه الأنظمة الطريق نحو أنظمة الخلايا الاصطناعية التي تحتوي على دهون أو عوامل إشارات موجودة44،45،46.

تاريخيا، كان ينظر إلى الأكتين والأنابيب الدقيقة على أنهما كيانان منفصلان، لكل منهما مجموعة خاصة به من البروتينات التنظيمية، والسلوكيات الديناميكية، والمواقع الخلوية المتميزة. تظهر الأدلة الوفيرة الآن أن بوليمرات الأكتين والأنابيب الدقيقة تشارك في آليات التداخل الوظيفية الضرورية لتنفيذ العديد من عمليات الخلايا بما في ذلك الهجرة وتحديد موضع المغزل الانقسامي والنقل داخل الخلايا ومورفولوجيا الخلية1،2،3،4. تعتمد السلوكيات المنسقة المتنوعة التي تكمن وراء هذه الأمثلة على توازن معقد بين عوامل الاقتران والإشارات والخصائص الفيزيائية. ومع ذلك ، فإن التفاصيل الجزيئية التي تدعم هذه الآليات لا تزال غير معروفة إلى حد كبير لأن معظم الدراسات تركز على بوليمر هيكلي خلوي واحد في وقتواحد 1،2،5.
الأكتين والأنابيب الدقيقة لا تتفاعل مباشرة6،7،8. يتم التوسط في الديناميكيات المنسقة للأكتين والأنابيب الدقيقة التي شوهدت في الخلايا بواسطة عوامل إضافية. تم تحديد العديد من البروتينات التي يعتقد أنها تنظم الأكتين والأنابيب الدقيقة المتقاطعة وتتميز أنشطتها بشكل جيد فيما يتعلق إما بالبوليمر الخلوي الهيكلي وحده 1,2. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن نهج البوليمر الواحد هذا قد أخفى الوظائف المزدوجة لبعض البروتينات / المجمعات التي تمكن أحداث اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة7،8،9،10،11،12،13. التجارب التي يوجد فيها كلا البوليمرات نادرة وغالبا ما تحدد الآليات ذات البوليمر الديناميكي الواحد والنسخة المستقرة الثابتة من 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 الأخرى . وبالتالي ، هناك حاجة إلى طرق للتحقيق في الخصائص الناشئة للبروتينات المنسقة بين الأكتين والأنابيب الدقيقة التي قد لا تكون مفهومة تماما إلا في الأنظمة التجريبية التي تستخدم كلا البوليمرات الديناميكية.
تم تطبيق مزيج من أساليب وضع العلامات المباشرة على البروتين ، وعلامات التقارب المشفرة وراثيا ، والفحص المجهري الكلي للتألق الداخلي للانعكاس (TIRF) بنجاح كبير في أنظمة إعادة التشكيل الحيوي19،20،21،22،23. لا تحتوي العديد من المخططات من أسفل إلى أعلى على جميع العوامل التي تنظم البروتينات في الخلايا. ومع ذلك ، فإن تقنية "الكيمياء الحيوية على غطاء زجاجي" قد صقلت العديد من آليات ديناميكيات الأكتين والأنابيب الدقيقة على نطاقات مكانية وزمنية عالية ، بما في ذلك المكونات اللازمة لتجميع البوليمر أو تفكيكه ، وحركة بروتين المحرك5،12،23،24،25،26،27 . هنا يتم وصف نهج الحد الأدنى من المكون أحادي الخيط للتحقيق في اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة في المختبر. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع البروتينات المتاحة تجاريا أو النقية للغاية ، والبروتينات ذات العلامات الفلورية ، وغرف التروية ، وتوسيعها إلى مخططات أكثر تعقيدا تحتوي على مستخلصات خلوية أو أنظمة اصطناعية. هنا ، يتم استخدام بروتين تاو المتاح تجاريا لتوضيح كيفية تغير ديناميكيات الهيكل الخلوي في وجود بروتين اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة ، ولكن يمكن استبداله بعوامل تنسيق الأكتين والأنابيب الدقيقة المفترضة الأخرى. الميزة الرئيسية لهذا النظام على النهج الأخرى هي القدرة على مراقبة ديناميكيات البوليمرات الخلوية الهيكلية المتعددة في وقت واحد في تفاعل واحد. كما يوفر هذا البروتوكول للمستخدمين أمثلة وأدوات بسيطة لتحديد التغيرات التي تطرأ على البوليمرات الهيكلية الخلوية. وبالتالي ، سينتج مستخدمو البروتوكول بيانات موثوقة وكمية وذات دقة أحادية الخيط لوصف الآليات التي تكمن وراء كيفية تنسيق البروتينات التنظيمية المتنوعة لديناميكيات الأكتين والأنابيب الدقيقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% BSA (w/v)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; BRB80</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td>Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc, Denver, CO</td>
			<td>T240</td>
			<td>Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer&#8217;s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM ATP</td>
			<td>Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO</td>
			<td>A-081</td>
			<td>Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM GTP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC226250010</td>
			<td>Resuspended in 1&#215; BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120-150 mW solid-state lasers</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11889151; 11889148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mg/mL catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td>
			<td>C40-100</td>
			<td>Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; TIRF buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>2&#215; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 &#181;L of 0.1M GTP and 1 &#181;L of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 &#215; 60 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>22-266882</td>
			<td>Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 oC water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mg/mL Streptavidin (600x stock)</td>
			<td>Avantor, Philadelphia, PA</td>
			<td>RLS000-01</td>
			<td>Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1&#215; in HEK buffer on day of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 min Epoxy resin and hardener</td>
			<td>Loctite, Rocky Hill, CT</td>
			<td>1365736</td>
			<td>Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>T333P</td>
			<td>(optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 oC incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin mix stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A 12.5 &#181;M actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 &#181;L of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 &#181;M (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appropriate buffer controls</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Combination of buffers from all proteins being assessed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-silane (MW 3,400)</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>biotin-PEG-SIL-3400</td>
			<td>Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AB07</td>
			<td>Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.&#160; Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dishsoap</td>
			<td>Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH</td>
			<td></td>
			<td>For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Software</td>
			<td>www.https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>Schneider et al. (2012)31.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled actin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AR05</td>
			<td>Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescently labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TL488M, TLA590M, TL670M</td>
			<td>Resuspended in 20 &#181;L 1&#215; BRB80 (10 &#181;M final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 &#215; g) for 60 min, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK Buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chambers</td>
			<td>IBIDI, Fitchburg, WI</td>
			<td>80666</td>
			<td>Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Life 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td>8114137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX Premium microscope software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11640611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose (4,000 cp)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope base equipped with TIRF module</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-silane (MW 2,000)</td>
			<td>Laysan Bio Inc, Arab, AL</td>
			<td>mPEG-SIL-2000</td>
			<td>Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater and heated stage insert</td>
			<td>OKO labs, Pozzioli, Italy</td>
			<td>8113569</td>
			<td>Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td>704504</td>
			<td>A syringe and tubing can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 100 x 15 mm</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide mailer container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick</td>
			<td>Grace Biolabs, Bend, OR</td>
			<td>620001</td>
			<td>Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small styrofoam container</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td></td>
			<td>Reused from shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small weigh boat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>TA01</td>
			<td>Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 &#181;M, when resuspended per manufacturer&#8217;s recommendations with 50 &#181;L of ddH20).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature corrected 63&#215; Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11506319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin stock</td>
			<td>Homemade; this protocol</td>
			<td></td>
			<td>A tubulin stock consisting of 7.2 &#181;L recycled 100 &#181;M unlabeled tubulin and 3 &#181;L of 10 &#181;M resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 &#181;M (4% labeled). More than 15 &#181;M tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 &#181;M free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled actin (dark)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc; Homemade</td>
			<td>AKL99</td>
			<td>Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 &#215; g before use.&#160;Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time&#160;is strongly recommended).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing actin and microtubule coupling dynamics in vitro by total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

تقليديا ، تمت دراسة الهياكل الخلوية للأكتين والأنابيب الدقيقة ككيانات منفصلة ، تقتصر على مناطق أو عمليات خلوية محددة ، وتنظمها مجموعات مختلفة من البروتينات الملزمة الفريدة لكل بوليمر. تظهر العديد من الدراسات الآن أن ديناميكيات كل من البوليمرات الخلوية الهيكلية متشابكة وأن هذا الحديث المتبادل مطلوب لمعظم السلوكيات الخلوية. تم بالفعل تحديد عدد من البروتينات المشاركة في تفاعلات الأكتين والأنابيب الدقيقة (أي تاو ، MACF ، GAS ، الفورمين ، وأكثر من ذلك) وهي تتميز بشكل جيد فيما يتعلق إما بالأكتين أو الأنابيب الدقيقة وحدها. ومع ذلك ، أظهرت دراسات قليلة نسبيا مقايسات تنسيق الأكتين والأنابيب الدقيقة مع الإصدارات الديناميكية من كلا البوليمرات. وهذا قد يحجب آليات الربط الناشئة بين الأكتين والأنابيب الدقيقة. هنا ، تسمح تقنية إعادة التشكيل في المختبر القائمة على التألق الداخلي الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF) بتصور كل من ديناميكيات الأكتين والأنابيب الدقيقة من تفاعل كيميائي حيوي واحد. تحافظ هذه التقنية على ديناميكيات البلمرة إما لخيوط الأكتين أو الأنابيب الدقيقة بشكل فردي أو في وجود البوليمر الآخر. يستخدم بروتين تاو المتوفر تجاريا لتوضيح كيفية تغير سلوكيات الأكتين والأنابيب الدقيقة في وجود بروتين تقليدي متقاطع بين الهيكل الخلوي. يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤى وظيفية وميكانيكية موثوقة حول كيفية تنسيق البروتينات التنظيمية الفردية لديناميكيات الأكتين والأنابيب الدقيقة بدقة خيوط مفردة أو مجمعات أعلى مرتبة.

مع الظروف الموضحة أعلاه (الشكل 1) ، يجب أن تكون بوليمرات الأكتين والأنابيب الدقيقة مرئية (وديناميكية) في غضون دقيقتين من الحصول على الصورة (الشكل 2). كما هو الحال مع أي بروتوكول قائم على الكيمياء الحيوية ، قد تكون هناك حاجة إلى التحسين للبروتينات التنظيمية المختلفة أو دفعات من البروتين. لهذه الأسباب ، يتم تعيين زاوية TIRF وتعرضات الصور أولا مع تفاعلات تحتوي على كل بوليمر فردي. هذا يؤكد أن البروتينات المخزنة وظيفية وأن هناك ما يكفي من البروتين المسمى للكشف. على الرغم من أنه ليس ضروريا دائما (ولا يتم تنفيذه هنا) ، إلا أنه يمكن استخدام المعالجة اللاحقة للأفلام (أي طرح الخلفية أو المتوسط أو تحويلات فورييه) لتحسين تباين الصورة (خاصة الأنابيب الدقيقة) 5،25،33. يدعم التصور المباشر لخيوط الأكتين المفردة والأنابيب الدقيقة التي يوفرها هذا الفحص التحديد الكمي لعدة مقاييس ديناميكية إما لمكون الهيكل الخلوي وحده أو معا ، بما في ذلك معلمات البلمرة (أي معدل النوى أو الاستطالة) ، ومعلمات التفكيك (أي معدلات الانكماش أو أحداث الكوارث) ، ومحاذاة / تداخل البوليمر (الشكل 3 ). علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه التدابير كنقطة انطلاق لفك ارتباط أو تأثير الروابط التنظيمية مثل تاو (الشكل 3). يمكن إجراء العديد من القياسات لخيوط الأكتين المفردة أو الأنابيب الدقيقة من فيلم TIRF واحد. ومع ذلك ، نظرا للاختلافات في طلاء الغطاء ، والسحب ، وعوامل أخرى ، يجب أن تتضمن القياسات الموثوقة أيضا تفاعلات / أفلام متعددة للتكرار التقني.
يمكن تحديد العديد من جوانب ديناميكيات الأنابيب الدقيقة من أمثلة الكيموجراف بما في ذلك معدل استطالة الأنابيب الدقيقة ، وكذلك تواتر أحداث الكوارث والإنقاذ (الشكل 3A). إن استخدام الكيموغراف لقياس ديناميكيات الأكتين في هذا النظام ليس بهذه البساطة لأن خيوط الأكتين أكثر تعقيدا من الأنابيب الدقيقة. ونتيجة لذلك ، يتم قياس معلمات ديناميكيات خيوط الأكتين باليد ، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا ويتطلب عمالة مكثفة. يتم قياس عدد النوى على أنه عدد خيوط الأكتين الموجودة في نقطة زمنية متسقة لجميع الظروف. تختلف هذه الأعداد على نطاق واسع عبر مجالات التصوير TIRF ، ولكن يمكن استخدامها مع العديد من النسخ المتماثلة أو لتكملة الملاحظات من اختبارات البلمرة الأخرى. يمكن أيضا استخدام تعداد النوى للأنابيب الدقيقة إذا كانت ظروف التجربة تفتقر إلى بذور الأنابيب الدقيقة المستقرة. يتم قياس معدلات استطالة خيوط الأكتين على أنها طول الخيوط بمرور الوقت من أربعة إطارات أفلام على الأقل. يتم نقل قيم المعدل لكل ميكرومولار أكتين مع عامل تصحيح قدره 370 وحدة فرعية لحساب عدد مونومرات الأكتين في ميكرون من خيوط (الشكل 3B)32. القياسات لتحديد السلوكيات المنسقة بين الأكتين والأنابيب الدقيقة أقل تحديدا. ومع ذلك ، تم تطبيق التحليلات المترابطة لقياس تزامن كل من البوليمرات بما في ذلك مسح الخطوط (الشكل 3C) أو البرامج المتداخلة5،11،34.
توافر البيانات: وقد أودعت جميع مجموعات البيانات المرتبطة بهذا العمل في زينودو وهي متاحة بطلب معقول على العنوان التالي: 10.5281/zenodo.6368327.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig01.jpg"> الشكل 1. المخططات التجريبية: تجميع غرفة التدفق للحصول على الصور. (أ) تجميع غرفة التصوير. من الأعلى إلى الأسفل: يتم تسجيل غرف التصوير IBIDI على طول آبار التروية (يشار إليها بالسهم) ؛ تتم إزالة الطبقة الثانية (البيضاء) من دعم الشريط (اليسار في الصورة الموضحة لتوجيه المستخدمين بشكل أفضل) ويتم تطبيق الإيبوكسي على حافة غرفة التروية (السهم). ملاحظة: لتوجيه المستخدمين بسهولة أكبر إلى مكان وضع الإيبوكسي، تم ترك الدعم الأبيض قيد التشغيل في هذه الصورة. يتم توصيل الغطاء النظيف والمطلي بغرفة التصوير مع جانب الطلاء المواجه للداخل من بئر التروية. (ب) مخطط انسيابي يوضح خطوات تكييف غرف التصوير للروابط بين البيوتين والستربتافيدين. (ج) أمثلة على التفاعلات المستخدمة للحصول على أفلام TIRF من الأنابيب الدقيقة الديناميكية وخيوط الأكتين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig02.jpg"> الشكل 2. تسلسل الصور لخيوط الأكتين المتنامية والأنابيب الدقيقة في غياب أو وجود تاو. مونتاج صور الفاصل الزمني من مقايسات TIRF التي تحتوي على 0.5 ميكرومتر من الأكتين (10٪ Alexa-647-actin و 0.09٪ البيوتين-أكتين الموسوم) و 15 ميكرومتر من التوبولين الحر (4٪ HiLyte-488 الموسوم) في غياب (A) أو وجود (B) من 250 نانومتر تاو. يظهر الوقت المنقضي من بدء التفاعل (خلط الأنبوب A والأنبوب B). أشرطة المقياس ، 25 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig03.jpg"> الشكل 3. مثال على قياسات الأنابيب الدقيقة وديناميكيات خيوط الأكتين. (أ) متوسط الإسقاط الزمني لقناة توبولين يصور بكفاءة إجمالي أطوال الأنابيب الدقيقة لمسح الخط المستخدم لإنشاء مخططات كيموجراف. تتوافق الخطوط السوداء المنقطة مع مثالين من الكيموغراف للأنابيب الدقيقة الديناميكية الموضحة على اليمين. يظهر النمو (الخطوط السوداء الصلبة) ومراحل التفكيك (الخطوط الوردية المنقطة ؛ اثنان يشار إليهما بأسهم وردية) للأنابيب الدقيقة على كل كيموجراف. شريط مقياس الوقت، 3 دقائق. شريط مقياس الطول ، 10 ميكرومتر. يحتوي التفاعل على 0.5 ميكرومتر من الأكتين (10٪ 647-label) و 15 ميكرومتر من التوبولين الحر (4٪ 488-HiLyte label). يتم عرض قناة tubulin فقط. (ب) مثالان على مونتاج الصور بفواصل زمنية يصوران خيوط أحادية الفعل تتبلمر بنشاط. يتم حساب معدلات الاستطالة على أنها ميل قطع الأراضي لطول خيوط الأكتين بمرور الوقت لكل أكتين ميكرومولار. وبالتالي ، يجب تطبيق عامل تصحيح من اثنين على تفاعلات الأكتين 0.5 ميكرومتر للمقارنة بين المعدلات التي تحدد عادة عند تركيز الأكتين 1 ميكرومتر. تظهر أمثلة من خمسة خيوط على اليمين. أشرطة المقياس ، 10 ميكرومتر. يحتوي التفاعل على 0.5 ميكرومتر من الأكتين (10٪ 647-label) و 15 ميكرومتر من التوبولين الحر (4٪ 488-HiLyte label). يتم عرض قناة أكتين فقط. (ج) صور TIRF للأنابيب الدقيقة الديناميكية (MT) (الخضراء) وخيوط الأكتين (الأرجواني) التي تتبلمر في غياب (يسار) أو وجود 250 نانومتر تاو (في الوسط). الخطوط الزرقاء المنقطة والأسهم تشير إلى المكان الذي تم فيه رسم خط لمخططات مسح الخط المقابلة لكل شرط (أسفل كل صورة). يمكن تسجيل التداخل بين الأنابيب الدقيقة ومناطق الأكتين (الموضحة باللون الأسود) في نقطة زمنية محددة لكل منطقة (يمين). قضبان المقياس ، 25 ميكرومتر. تحتوي التفاعلات على 0.5 ميكرومتر من الأكتين (10٪ 647-label) و 15 ميكرومتر من التوبولين الحر (4٪ 488-HiLyte label) مع أو بدون 250 نانومتر تاو. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy at JoVE.com

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

هذا البروتوكول هو دليل لتصور الأكتين الديناميكي والأنابيب الدقيقة باستخدام الفحص المجهري الداخلي الكلي للتألق في المختبر (TIRF).

تصور ديناميكيات اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة في المختبر بواسطة المجهر الكلي للتألق الداخلي (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

على الرغم من العديد من الأمثلة على التنسيق ، فإن معظم الدراسات تفحص بروتينات الأكتين أو الأنابيب الدقيقة بشكل فردي. تسمح هذه الطريقة بتصور كل من البوليمرات الديناميكية في تفاعل واحد. تسمح هذه التقنية للمستخدم بتقييم البروتينات التنظيمية المتنوعة للخصائص الناشئة التي لا يمكن رؤيتها إلا من خلال الإصدارات الديناميكية من الأكتين والأنابيب الدقيقة.يمكن توسيع هذه التقنية لتشمل الدهون أو المستخلصات للاقتراب من بناء خلية اصطناعية. ابدأ بإذابة أليكوتس مساحيق PEG-Silane و Biotin-PEG-Silane ، وإذابة مساحيق PEG في 80٪ من الإيثانول لتوليد حلول مخزون الطلاء من 10 ملليغرام لكل ملليلتر mPEG-Silane واثنين إلى أربعة ملليغرام لكل ملليلتر Biotin-PEG-Silane. قم بإزالة الغطاء النظيف من تخزين الإيثانول باستخدام الملقط.يجف بغاز النيتروجين ويخزن في طبق بتري نظيف. قم بتغطية الغطاء ب 100 ميكرولتر من محلول الطلاء واحتضنها عند 70 درجة مئوية لمدة 18 ساعة على الأقل أو حتى الاستخدام. اقطع 12 شريطا من الشريط المزدوج المدعوم على الوجهين بطول 24 ملم.قم بإزالة جانب واحد من دعامة الشريط وقم بإصلاح قطع الشريط المجاورة للأخاديد الستة الموجودة على غرفة تصوير نظيفة. قم بإزالة القطعة الثانية من الشريط الخلفي لفضح الجانب اللزج من الشريط على طول كل أخدود حجرة ، وضع جانب شريط الغرفة على سطح نظيف. امزج راتنجات الإيبوكسي وحلول التقوية واحدا تلو الآخر في قارب وزن صغير ، واستخدم طرف P1000 لوضع قطرة من الإيبوكسي المختلط بين شرائط الشريط في نهاية كل أخدود غرفة تصوير.ثم ، ضع الغرفة أو الشريط أو جانب الإيبوكسي لأعلى ، على سطح نظيف. قم بإزالة زلة الغطاء المطلي من الحاضنة 70 درجة مئوية وشطف الأسطح المطلية وغير المطلية من انزلاقات الغطاء بالماء المقطر المزدوج ست مرات. يجف بغاز النيتروجين المصفى ثم يلصق على غرفة التصوير مع جانب طلاء الغطاء باتجاه الشريط.استخدم طرف ماصة P200 أو P1000 للضغط على الواجهة الزجاجية المسجلة لضمان وجود ختم جيد بين الشريط وانزلاق الغطاء. احتضن الغرف المجمعة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق على الأقل للسماح للإيبوكسي بإغلاق آبار الغرفة بالكامل قبل الاستخدام. تنتهي صلاحية غرف التروية في غضون 12 إلى 18 ساعة من التجميع.استخدم مضخة التروية وتبادل حلول التكييف بالتتابع في غرفة التروية عن طريق تدفق 50 ميكرولتر من 1٪ BSA لتشغيل غرفة التصوير. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من خزان تركيب قفل الإغراء. ثم ، تدفق 50 ميكرولتر من 0.005 ملليغرام لكل ملليلتر ستربتافيدين وحضانة لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من الخزان. تدفق 50 ميكرولتر من 1٪ BSA لمنع الارتباط غير المحدد واحتضانه لمدة 10 إلى 30 ثانية. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من الخزان.بعد ذلك ، قم بتدفق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت الدافئ 1x TIRF ثم 50 ميكرولتر من بذور الأنابيب الدقيقة المستقرة و 50٪ البيوتينيل المخففة في مخزن مؤقت 1x TIRF. اضبط جهاز السخان المسرحي أو الموضوعي للحفاظ على درجة حرارة 35 إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل تصوير أول تفاعل كيميائي حيوي. ثم اضبط الفاصل الزمني للاكتساب على كل خمس ثوان لمدة 15 إلى 20 دقيقة.بعد ذلك ، اضبط 488 و 647 تعرضا بالليزر على 50 إلى 100 مللي ثانية عند 5٪ إلى 10٪ من الطاقة عن طريق ضبط تفاعل البلمرة أولا لبدء تجميع خيوط الأكتين. احصل على الصور بسرعة 647 نانومتر وقم بإجراء التعديلات المناسبة. ثم ، اضبط تفاعل البلمرة في تروية مشروطة ثانية جيدا لبدء تجميع الأنابيب الدقيقة.تصور عند 488 نانومتر وإجراء التعديلات المناسبة. اجمع ثلاثة ميكرولترات من 10 ميكرومولار 488 توبولين مع 7.2 ميكرولتر أليكوت من 100 توبولين فلورسنت غير مسمى بما لا يزيد عن 15 دقيقة قبل الاستخدام. بعد ذلك ، قم بدمج ثلاثة ميكرولترات من الأكتين المرتبط بالبيوتين المخفف في كميات مناسبة من الأكتين غير المسمى والموسوم بالفلورسنت بحيث يكون المزيج النهائي 12.5 ميكرومولار إجمالي الأكتين مع 10٪ إلى 30٪ من التسمية الفلورية.تحضير مزيج الهيكل الخلوي عن طريق الجمع بين اثنين من الميكرولترات من 12.5 ميكرومولار الأكتين مزيج مع مزيج الأسهم توبولين لا يزيد عن 15 دقيقة قبل التصوير. يحفظ على الثلج حتى الاستخدام. قم بإعداد مزيج تفاعل البروتين من خلال الجمع بين جميع المكونات والبروتينات التجريبية الأخرى ، بما في ذلك المخزن المؤقت 2x TIRF ، ومضاد التبييض ، والنيوكليوتيدات ، والمخازن المؤقتة ، والبروتينات الملحقة.احتضان مزيج الهيكل الخلوي ومزيج تفاعل البروتين بشكل منفصل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 ثانية. لبدء التفاعل ، أضف محتويات مزيج تفاعل البروتين إلى مزيج الهيكل الخلوي واخلطه. تدفق 50 ميكرولتر من مزيج التفاعل الذي يحتوي على 1x TIRF المخزن المؤقت مع استكمال 15 توبولين حرة ميكرومولار ، واحد مليمولار GTP ، 0.5 ميكرومولار أكتين مونومرات ، وأحجام مناسبة من ضوابط العازلة إلى غرفة التروية.سجل فيلما بفاصل زمني باستخدام برنامج المجهر للحصول عليه كل خمس ثوان لمدة 15 إلى 20 دقيقة. قم بتهيئة بئر تروية جديد واستبدل حجم المخزن المؤقت بالبروتين التنظيمي ذي الأهمية وعناصر التحكم في المخزن المؤقت. الحصول على تقييم البروتينات التنظيمية لوظائف الأكتين microtubule الناشئة.يتم عرض أمثلة على قياسات الأنابيب الدقيقة وديناميات خيوط الأكتين في هذه الصور. يتصور متوسط الإسقاط الزمني لقناة توبولين بكفاءة إجمالي أطوال الأنابيب الدقيقة لمسح الخط المستخدم لإنشاء مخططات Kymograph. تتوافق الخطوط السوداء المنقطة مع مثالين Kymographs للأنابيب الدقيقة الديناميكية.تظهر مراحل النمو والتفكيك للأنابيب الدقيقة على كل Kymograph. يتم عرض مثالين على مونتاج صور الفاصل الزمني الذي يصور خيوط الأكتين المفردة التي تتبلمر بنشاط هنا. يتم حساب معدلات الاستطالة على أنها ميل قطع الأراضي لطول خيوط الأكتين بمرور الوقت لكل أكتين ميكرومولار.وبالتالي ، يجب تطبيق عامل تصحيح من اثنين على تفاعلات الأكتين ميكرومولار 0.5 لمقارنة المعدلات التي تحدد عادة عند تركيز الأكتين ميكرومولار واحد. يتم عرض أمثلة من خمسة خيوط هنا. يظهر هنا إجمالي تألق الانعكاس الداخلي ، أو صور TIRF للأنابيب الدقيقة الديناميكية في خيوط الأكتين التي تتبلمر في غياب أو وجود 250 نانومولار تاو.الخطوط الزرقاء المنقطة وعلامات الأسهم ارتداء خط تم رسمه لمخططات مسح الخط المقابلة لكل شرط. يمكن تسجيل التداخل بين الأنابيب الدقيقة في مناطق الأكتين في نقطة زمنية محددة لكل منطقة. البروتينات الخلوية الهيكلية ، وتحديدا الأكتين ، والأنابيب الدقيقة ، ومنظميها حساسة للغاية لدورات التجميد / الذوبان.من أجل الاتساق والنجاح ، استخدم بروتينات عالية النقاء ومخزنة بشكل صحيح.