Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Traditioneel zijn de actine- en microtubulecytoskeletten bestudeerd als afzonderlijke entiteiten, beperkt tot specifieke cellulaire regio's of processen en gereguleerd door verschillende suites van bindende eiwitten die uniek zijn voor elk polymeer. Veel studies tonen nu aan dat de dynamiek van beide cytoskeletale polymeren met elkaar verweven is en dat deze kruisverwijzing nodig is voor de meeste cellulaire gedragingen. Een aantal eiwitten die betrokken zijn bij actine-microtubule interacties zijn al geïdentificeerd (d.w.z. Tau, MACF, GAS, formins en meer) en zijn goed gekarakteriseerd met betrekking tot actine of microtubuli alleen. Relatief weinig studies toonden echter testen van actine-microtubulecoördinatie met dynamische versies van beide polymeren. Dit kan emergente verbindingsmechanismen tussen actine en microtubuli uitsluiten. Hier maakt een op in vitro reconstitutie gebaseerde in vitro reconstitutietechniek op basis van totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) de visualisatie van zowel actine- als microtubulidynamiek van de ene biochemische reactie mogelijk. Deze techniek behoudt de polymerisatiedynamiek van actinefilament of microtubuli afzonderlijk of in aanwezigheid van het andere polymeer. Commercieel beschikbaar Tau-eiwit wordt gebruikt om aan te tonen hoe actine-microtubule gedrag verandert in de aanwezigheid van een klassiek cytoskeletaal crosslinking-eiwit. Deze methode kan betrouwbare functionele en mechanistische inzichten bieden in hoe individuele regulerende eiwitten de dynamiek van actine-microtubuli coördineren met een resolutie van enkele filamenten of complexen van hogere orde.