Visualisierung der Dynamik der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in vitro durch Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF)

Traditionell wurden die Aktin- und Mikrotubuli-Zytoskelette als separate Einheiten untersucht, die auf bestimmte zelluläre Regionen oder Prozesse beschränkt sind und durch verschiedene Suiten von Bindungsproteinen reguliert werden, die für jedes Polymer einzigartig sind. Viele Studien zeigen nun, dass die Dynamik beider zytoskelettaler Polymere miteinander verflochten ist und dass dieses Übersprechen für die meisten zellulären Verhaltensweisen erforderlich ist. Eine Reihe von Proteinen, die an Aktin-Mikrotubuli-Interaktionen beteiligt sind, wurden bereits identifiziert (z. B. Tau, MACF, GAS, Formine und mehr) und sind entweder in Bezug auf Aktin oder Mikrotubuli allein gut charakterisiert. Relativ wenige Studien zeigten jedoch Assays der Aktin-Mikrotubuli-Koordination mit dynamischen Versionen beider Polymere. Dies kann emergente Verbindungsmechanismen zwischen Aktin und Mikrotubuli ausschließen. Dabei ermöglicht eine auf der Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF) basierende In-vitro-Rekonstitutionstechnik die Visualisierung sowohl der Aktin- als auch der Mikrotubuli-Dynamik aus der einen biochemischen Reaktion. Diese Technik bewahrt die Polymerisationsdynamik von Aktinfilament oder Mikrotubuli einzeln oder in Gegenwart des anderen Polymers. Das kommerziell erhältliche Tau-Protein wird verwendet, um zu demonstrieren, wie sich das Verhalten von Aktin-Mikrotubuli in Gegenwart eines klassischen zytoskelettalen Vernetzungsproteins ändert. Diese Methode kann zuverlässige funktionelle und mechanistische Einblicke liefern, wie einzelne regulatorische Proteine die Aktin-Mikrotubuli-Dynamik bei einer Auflösung einzelner Filamente oder Komplexe höherer Ordnung koordinieren.