Visualizzazione delle dinamiche di accoppiamento di actina e microtubuli in vitro mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Tradizionalmente, i citoscheletri di actina e microtubuli sono stati studiati come entità separate, limitate a specifiche regioni o processi cellulari e regolate da diverse suite di proteine leganti uniche per ciascun polimero. Molti studi ora dimostrano che le dinamiche di entrambi i polimeri citoscheletrici sono intrecciate e che questa diafonia è necessaria per la maggior parte dei comportamenti cellulari. Un certo numero di proteine coinvolte nelle interazioni actina-microtubulo sono già state identificate (ad esempio, Tau, MACF, GAS, formine e altro) e sono ben caratterizzate per quanto riguarda l'actina o i microtubuli da soli. Tuttavia, relativamente pochi studi hanno mostrato saggi di coordinazione actina-microtubulo con versioni dinamiche di entrambi i polimeri. Ciò può occludere i meccanismi di collegamento emergenti tra actina e microtubuli. Qui, una tecnica di ricostituzione in vitro basata sulla microscopia a riflessione interna totale (TIRF) consente la visualizzazione della dinamica dell'actina e dei microtubuli dall'unica reazione biochimica. Questa tecnica preserva la dinamica di polimerizzazione del filamento di actina o dei microtubuli singolarmente o in presenza dell'altro polimero. La proteina Tau disponibile in commercio viene utilizzata per dimostrare come i comportamenti dell'actina-microtubulo cambiano in presenza di una classica proteina reticolante citoscheletrica. Questo metodo può fornire informazioni funzionali e meccanicistiche affidabili su come le singole proteine regolatrici coordinano la dinamica actina-microtubulo a una risoluzione di singoli filamenti o complessi di ordine superiore.